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文檔簡介
1、研究背景:已有研究證明,人體內樹突狀細胞(DCs)亞群,在許多疾病包括結核病(TB)中都有不同程度的改變,但在不同分期肺結核(PTB)患者體內DCs亞群的變化有何不同尚不清楚。已有報導結核分枝桿菌對DCs的功能有抑制作用,從結核桿菌H37Ra株中提取的結核桿菌耐熱性抗原(Mtb-HAg)是一種能優(yōu)勢誘導γδ-T細胞活化的小分子多肽,但對DCs的成熟和功能有何影響也尚未報道。
目的:研究不同分期肺結核患者外周血來源的DCs亞群即
2、髓樣樹突狀細胞(myeloid dendritic cells, MDC)和淋巴樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cell, PDC)的變化,及Mtb-HAg在體外對人外周血單核細胞來源的DCs誘導成熟的影響。
方法:
1.DCs亞群測定方法:采集32例健康者(HD)和56例PTB患者外周靜脈抗凝全血,用四色熒光抗體染色后在流式細胞儀檢測和分析 DCs亞群, MDC(Lin-HLA-DR+C
3、D11c+),和 PDC(Line-HLA-DR+CD123+),根據診治情況又將PTB患者分為初治組和復治組。
2.DCs培養(yǎng)方法:從健康人外周血,分離獲取外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)后,用貼壁法獲得單核細胞,加GM-CS和IL-4培養(yǎng)7天,再用LPS或Mtb-HAg誘導再培養(yǎng)2 d。
3.培養(yǎng)DCs的形態(tài)學觀察:取培養(yǎng)第2 d的細胞及第9 d
4、經Mtb-HAg誘導的DCs,用抗CD14-FITC、抗CD11c-APC染色后在熒光顯微鏡下觀察細胞表面標志的表達。4.培養(yǎng)DCs的表型測定:培養(yǎng)的DCs用熒光抗體標記后,用流式細胞儀檢測細胞表面共刺激分子CD80,CD86和HLA-DR及DCs成熟的標志CD83,以及MDC表面標志CD11c、PDC的表面標志CD123的表達。
5.混合淋巴細胞反應:CFSE標記的純化T淋巴細胞與Mtb-HAg或LPS誘導的DCs共同培養(yǎng),
5、第9 d用流式細胞儀檢測和分析T淋巴細胞增殖指數。
結果:
1. PTB患者(n=56)的PDC(0.91±0.10)%顯著低于 HD組(n=32)(1.62±0.14)%(P<0.05),MDC在PTB組、HD組之間無差異(P=0.17),PTB患者的MDC/PDC比值也明顯高于HD組(P<0.05)。
2. PTB復治組(n=25)的PDC(0.63±0.09)%明顯低于初治組(n=31)(1.14±0
6、.16)%和HD組(n=32)(1.63±0.15)%(p均<0.05),但初治組與HD組之間無差異。而MDC在三組之間并無差異(P=0.08)。但是MDC/PDC比值在PTB復治組(5.30±1.35)明顯高于初治組(3.52±0.53)和HD組(1.84±0.16)(p均<0.05)。
3.體外培養(yǎng)的單核細胞來源的DCs,經 Mtb-HAg誘導后,形態(tài)上為典型成熟的DCs,表現為細胞體積增大,不規(guī)則,細胞周邊可見較長的毛刺
7、狀突起。用熒光顯微鏡觀察發(fā)現,培養(yǎng)初期的單核細胞表達CD14,培養(yǎng)成熟后多為表達MDC標志CD11c。
4.外周血單核細胞經rhGM-CSF和rhIL-4培養(yǎng)7 d,再經Mtb-HAg誘導2 d后,單核細胞標志 CD14小于10%,高表達成熟標記 CD83(64.45%),共刺激分子CD86(76.3%) CD80(78.87%)及 HLA-DR(76.48)%,大多數細胞表達 MDC標志CD11c(74.98)%,少數表達P
8、DC標志CD123(10.31)%。
5.用Modift軟件分析CFSE標記純化T細胞與三組DCs混合培養(yǎng)9 d后的細胞增殖指數(PI)發(fā)現,Mtb-HAg誘導組的PI(41.47±5.64)%明顯大于陰性對照組(9.16±5.24)%,(P<0.05),與LPS誘導陽性對照組(34.71±6.21)%無差異。
結論:
1.與HD組相比,PTB患者DC亞群中PDC的數量明顯減少,而MDC變化不明顯,同時MD
9、C/PDC的比值也明顯升高。
2. PTB復治組患者PDC均明顯低于初治組和HD組,MDC/PDC比值明顯高于初治組和HD組,而初治組與HD組之間無明顯差異;MDC在三組之間無差異;提示PDC數量與病情進展密切相關。
3. Mtb-HAg可上調外周血單核細胞來源DCs的協(xié)同刺激分子和成熟標志表達,以及增強MLR反應,提示Mtb-HAg有誘導DCs成熟和增強抗原提呈功能的作用。
4. Mtb-HAg誘導外周血
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