1、第一部分大鼠肝移植模型改進(jìn) 目的：探索建立穩(wěn)定大鼠原位肝移植模型的方法，為進(jìn)一步研究大鼠肝臟冷保存再灌注損傷提供模型基礎(chǔ)。 方法：選用清潔級(jí)SD大鼠建立同種異體原位肝移植模型，手術(shù)采用“Kamada雙袖套法”，并在其基礎(chǔ)上做適當(dāng)改進(jìn)，如：采用靜脈注射泵代替手工灌注，留取供體肝上下腔靜脈膈環(huán)以上2mm靜脈進(jìn)行成形，并于靜脈壁左右側(cè)分別預(yù)吊縫線(xiàn)等。手術(shù)分為第一階段預(yù)實(shí)驗(yàn)(50次)和第二階段正式實(shí)驗(yàn)(50次)進(jìn)行，在第二階段又

2、按術(shù)式分為“Kamada雙袖套法”(26次)和“改良Kamada雙袖套法”(24次)，并比較二種術(shù)式建立大鼠肝移植模型的效果。 結(jié)果：預(yù)試驗(yàn)期間手術(shù)存活率為34.00％(17/50)，正式實(shí)驗(yàn)手術(shù)存活率達(dá)90.20％(46/50)。“改良Kamada雙袖套法”的供、受體手術(shù)時(shí)間，袖套準(zhǔn)備及供肝修整時(shí)間，無(wú)肝期都比“Kamada雙袖套法”有明顯縮短；術(shù)后一周的存活率顯示“Kamada雙袖套法”為65.21％(15/23)，“改良K

3、amada雙袖套法”為95.73％(22/23)，統(tǒng)計(jì)分析具有顯著性差異(P<0.05)。 結(jié)論： 1.“改良Kamada雙袖套法”具有無(wú)肝期和手術(shù)時(shí)間短，手術(shù)成功率和術(shù)后存活率高的優(yōu)點(diǎn)，是建立大鼠原位肝移植模型較為理想的術(shù)式； 2.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)取肝、修肝、受體肝臟切除、肝上下腔靜脈吻合、圍手術(shù)期處理等幾方面的改進(jìn)，提高了模型的穩(wěn)定性和成功率。 第二部分匹立尼酸對(duì)不同冷保存時(shí)間大鼠肝臟內(nèi)PPARα、NF-

4、кB和iNOS的影響 目的：探索匹立尼酸對(duì)冷保存大鼠肝臟內(nèi)PPARα、NF-кB和iNOS的影響，研究其對(duì)移植肝冷保存損傷的作用和作用機(jī)制。 方法：將60只SD大鼠隨機(jī)分成二大組：匹立尼酸預(yù)處理組(P2)，30只，于術(shù)前2d、1d、1h分別經(jīng)尾靜脈一次注入10％DSMO8ml/kg.d+Pirinixie acid 3mg/kg.d；對(duì)照組(C2)，30只，則注入相應(yīng)劑量的10％DSMO溶劑。按“改良Kamada雙袖套法

5、”切取大鼠供肝，然后，每組又按在4℃林格氏液中冷保存時(shí)間不同分為五個(gè)亞組：冷保存0h組，6只；冷保存2h組，6只；冷保存4h組，6只；冷保存6h組，6只；冷保存8h組，6只。分別于上述不同時(shí)間點(diǎn)分批次采取肝中葉標(biāo)本，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Western-Blot)檢測(cè)過(guò)氧化物酶體增殖物激活劑受體(PPAR)α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA及表達(dá)蛋白量的變化，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)核因子(N

6、F)-кB活性變化，并比較二組的病理學(xué)特征。 結(jié)果：在對(duì)照組(C2)和匹立尼酸預(yù)處理組(P2)肝組織中，隨著冷保存時(shí)間的延長(zhǎng)PPARαmRNA和表達(dá)蛋白的量都逐漸降低，但同一時(shí)間點(diǎn)P2組比C2組要高，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較具有顯著性差異(P<0.05)。在C2組和P2組肝組織中iNOS mRNA和表達(dá)蛋白的量隨著冷保存時(shí)間延長(zhǎng)都升高，但同一時(shí)間點(diǎn)P2組比C2組要低，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較也具有顯著性差異(P<0.05)。同一冷保存時(shí)間點(diǎn)匹立尼酸預(yù)處理組

7、肝細(xì)胞內(nèi)NF-кB的激活水平低于對(duì)照組，病理?yè)p傷也較對(duì)照組輕。 結(jié)論： 1、PPARα在冷保存的大鼠肝臟中表達(dá)下調(diào)，并隨冷保存時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)水平逐漸下降(在林格氏液中冷保存，8小時(shí)內(nèi))； 2、Wv-14643對(duì)大鼠肝臟冷保存損傷具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用是通過(guò)改善PPARα的表達(dá)下調(diào)、抑制NF-кB的活化和iNOS的病理性高表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 第三部分匹立尼酸對(duì)大鼠移植肝冷保存再灌注損傷的保護(hù)作用和作用機(jī)制

8、 目的：進(jìn)一步撟索匹立尼酸對(duì)大鼠移植肝冷保存后再灌注期損傷的作用，并了解其作用機(jī)制。 方法：將90只清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分成三組：對(duì)照組(C3組)，18只，于術(shù)前2d、1d、1h分別經(jīng)尾靜脈一次注入10％DSMO 8ml/kg.d，只行開(kāi)關(guān)腹及肝臟游離手術(shù)；匹立尼酸處理組(P3組)，36只；模型組(M3)，36只。Ms和P3組動(dòng)物再隨機(jī)分成供體、受體，P3組供體于術(shù)前2d、1d、1h分別經(jīng)尾靜脈一次注入10％DSMO 8ml/

9、kg.d+Pirinixicacid 3mg/kg.d，M3組供體則注入相應(yīng)劑量的10％DSMO溶劑，后二組按前述的“改良kamada雙袖套法”建立肝移植模型。然后，三組動(dòng)物又以術(shù)后再灌注時(shí)間點(diǎn)不同再分為三個(gè)亞組：即T1：再灌注2小時(shí)，T2：再灌注6小時(shí)；T3：再灌注24小時(shí)；各6只。分別按上述時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)肝組織中PPARα、iNOS mRNA及表達(dá)蛋白的量、髓過(guò)氧化物酶活力(MPO)、超氧化物酶活力(SOD)、丙二醛含量(MDA)、肝細(xì)

10、胞中NF-кB活性和血清中谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、腫瘤壞死因子(TNF)α、巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)-2的變化，并比較三組肝臟的病理學(xué)差異。 結(jié)果：對(duì)照組(C3)術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)肝組織中PPARα、iNOS mRNA及表達(dá)蛋白的量、MPO活力、SOD活力、MDA含量、肝細(xì)胞中NF-кB活性和血清中ALT、AST、TNFα、MIP-2的都無(wú)明顯變化，肝臟的病理學(xué)無(wú)顯著改變。模型組(M3)和匹立尼酸預(yù)處理

11、組(P3)PPARαmRNA及表達(dá)蛋白的量、SOD活力、隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，6h達(dá)到最低點(diǎn)，以后逐漸恢復(fù)，同一時(shí)間點(diǎn)三組的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，具有顯著性差異(P<0.05)，P3比M3組下降的幅度低，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析也具有顯著性差異(P<0.05)。相反，肝臟中iNOS mRNA及表達(dá)蛋白的量、MDA含量和血清中ALT、AST、MIP-2在M3和P3組則于再灌注開(kāi)始時(shí)上升，6小時(shí)達(dá)到高峰，以后下降，同一時(shí)間點(diǎn)三組的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，具有顯著性差

12、異(P<0.05)，P3組比M3組升高的幅度低，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析也具有顯著性差異(P<0.05)，但MIP-2在P3組和M3組卻無(wú)顯著性差異。M3和P3組肝細(xì)胞中的NF-кB活性、血清中TNFα隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)于開(kāi)始時(shí)上升，2小時(shí)達(dá)到高峰，以后逐漸下降，同一時(shí)間點(diǎn)三組的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，具有顯著性差異(P<0.05)，P3組比M3組低，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析也具有顯著性差異(P<0.05)，但血清中TNFα在P3組和M3組卻無(wú)顯著性差異。肝臟病理學(xué)檢查，P

13、3組比M3組損傷輕。 結(jié)論： 1、在冷保存.再灌注損傷早期(再灌注后6h內(nèi))，大鼠移植內(nèi)PPARα表達(dá)繼續(xù)下調(diào)，于再灌注6h達(dá)到最低點(diǎn)，24h時(shí)有所回升； 2、Wy-14643對(duì)大鼠移植肝前期(再灌注后24h內(nèi))冷保存一再灌注損傷具有保護(hù)作用，其作用是通過(guò)改善PPARα的下調(diào)表達(dá)，抑制肝細(xì)胞內(nèi)NF-кB的激活，調(diào)控肝臟內(nèi)一氧化氮合酶(iNOS)的轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制iNOS源性NO的生成，進(jìn)而抑制iNOS源性超氧化物和過(guò)氧