1、缺血性腦血管病是臨床常見病、多發(fā)病之一，根據(jù)國際衛(wèi)生組織統(tǒng)計，在全球范圍內(nèi)平均每400個人中就有一個缺血性腦血管病患者，缺血性腦血管病造成的死亡率僅次于心臟疾病，在所有的缺血性腦血管病患者中有大約30％患者由于溶栓治療或栓子自發(fā)向遠(yuǎn)端推移出現(xiàn)血管再通，而出現(xiàn)缺血再灌注損傷。隨著現(xiàn)代免疫學(xué)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，認(rèn)為腦缺血再灌注損傷的病理生理機(jī)制是一種損傷級聯(lián)反應(yīng)，主要包括興奮性氨基酸毒性、氧化應(yīng)激、凋亡、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、自由基損傷、炎癥損

2、害等，這幾種因素相互作用、相互影響，構(gòu)成了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死。
　　 目前已有許多合成或天然物質(zhì)的神經(jīng)保護(hù)劑進(jìn)入實驗研究，雖然理論上應(yīng)用神經(jīng)保護(hù)劑可治療腦梗死，但是這些神經(jīng)保護(hù)劑在臨床治療中并沒有取得預(yù)期的效果，出現(xiàn)臨床和理論的嚴(yán)重脫節(jié)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象最主要的原因是動物與人類生理機(jī)制及耐受性等方面的差異，另外，由于腦缺血后級聯(lián)反應(yīng)的復(fù)雜性，可能單一使用阻斷某一病理環(huán)節(jié)的藥物難以奏效。在我們目前

3、的臨床治療中，理想的神經(jīng)保護(hù)劑應(yīng)該具備針對缺血再灌注損傷多個損傷環(huán)節(jié)發(fā)揮“一個靶點，多重保護(hù)”作用的特性。
　　 熊果酸(UA)是存在于天然植物中的一種五環(huán)三萜系化合物，主要存在于熊果、夏枯草、鐵冬青等植物中。研究表明UA具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗凋亡、抗病毒、增強(qiáng)免疫功能等多種生物學(xué)作用，并且毒副作用低，具有良好的臨床應(yīng)用潛力。臨床上，缺血性腦血管疾病多為局灶性，部分患者由于溶栓治療或栓子自發(fā)向遠(yuǎn)端推移出現(xiàn)血管再通即再灌注現(xiàn)

4、象，因此，制備局灶性腦梗死并且可實現(xiàn)再灌注的動物模型更為接近臨床實際情況。
　　 本研究選用雄性CD-1小鼠、Nrf2-/-、Nrf2+/+小鼠為研究對象，采用線栓法建立腦缺血再灌注模型，動態(tài)觀察缺血再灌注損傷后Nrf2/ARE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與氧化損傷、炎癥反應(yīng)及神經(jīng)分化的關(guān)系，并選用五環(huán)三萜系化合物UA進(jìn)行干預(yù)，評價干預(yù)前后梗死體積、神經(jīng)功能缺損評分，以及UA對Nrf2/ARE信號通路的激活在缺血再灌注損傷后的腦保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行

5、初步探討。本研究分三部分，現(xiàn)將各部分內(nèi)容概述如下。
　　 第一部分熊果酸對局灶性腦缺血再灌注損傷小鼠的抗氧化作用及其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究
　　 目的：觀察腦缺血再灌注損傷后不同時間點Nrf2/ARE通路的活性變化，研究熊果酸對缺血再灌注小鼠的抗氧化作用，探討熊果酸抗氧化作用的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 方法：選用成年雄性CD-1小鼠、Nrf2-/-、Nrf2+/+小鼠為研究對象，采用改良線栓法制備大腦中動脈缺血再灌

6、注模型。試驗1：隨機(jī)將CD-1小鼠分為2組：假手術(shù)組(Sham)(n=30)，手術(shù)組(MCAO)，每組又根據(jù)不同的時間點分為3h、24h、48h、72h、7d五個亞組(n=90)。試驗2：隨機(jī)將CD-1小鼠分為4組：假手術(shù)組(Sham)、手術(shù)組(Vehicle)、小劑量熊果酸干預(yù)組(L-UA)(68mg/Kg)、大劑量熊果酸干預(yù)組(H-UA)(130mg/Kg)。試驗3：采用隨機(jī)的方法分別將Nrf2-/-、Nrf2+/+小鼠分為3組：假

7、手術(shù)組(Sham)、手術(shù)組(Vehicle)、大劑量熊果酸干預(yù)組(H-UA)(130mg/Kg)。Sham組：假手術(shù)后腹腔注射等量PBS+1％DMSO，Vehicle組：缺血再灌注術(shù)后腹腔注射等量PBS+1％DMSO，L-UA組：缺血再灌注術(shù)后腹腔注射熊果酸68mg/Kg。H-UA組：缺血再灌注術(shù)后腹腔注射熊果酸130mg/Kg。各組取材前進(jìn)行神經(jīng)功能評分，TTC染色評價腦梗死體積，HE染色觀察組織學(xué)改變，檢測腦組織中丙二醛(MDA)含

8、量的變化情況，分別用RT-qPCR的方法和Western blot的方法檢測缺血腦組織Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白水平的變化、Confocal觀察Nrf2核轉(zhuǎn)位的形態(tài)學(xué)改變。
　　 結(jié)果：在缺血再灌注早期Nrf2、HO-1、MDA的表達(dá)呈逐漸升高的趨勢，至24h達(dá)高峰，持續(xù)到48h，自72h開始逐漸下降。兩種劑量熊果酸干預(yù)后均可以改善腦缺血再灌注后小鼠的神經(jīng)功能缺失評分，H-UA組與Vehicle組相比可明顯降低神經(jīng)功能缺

9、損，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(1.78±0.30vs．2.47±0.46)(P＜0.05)，而L-UA組與Vehicle組相比可降低神經(jīng)功能缺損，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(2.01±0.65vs.2.47±0.46)(P＞0.05)，兩種劑量熊果酸干預(yù)后均可降低腦缺血再灌注后小鼠的腦梗死體積，H-UA組與Vehicle組相比可明顯減輕梗死體積，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.30±0.02vs.0.48±0.04)(P＜0.05)，而L-UA組與Vehicle

10、組相比可減輕梗死體積，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(0.38±0.03vs.0.48±0.04)(P＞0.05)。+兩種劑量熊果酸干預(yù)后均可降低腦缺血再灌注后小鼠的MDA含量，H-UA組與Vehicle組相比可明顯減低MDA含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2.06±0.29vs．3.55±0.67)(P＜0.05)，而L-UA組與Vehicle組相比可降低MDA含量，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(2.98±0.56vs.3.55±0.67)(P＞0.05)。Nrf

11、2、HO-1mRNA表達(dá)以RQ值表示，Sham組、Vehicle組、L-UA組、H-UA組Nrf2與HO-1的RQ值分別為：0.22±0.27，0.85±0.10，0.70±0.05，0.53±0.06;0.70±0.02，1.80±0.04，1.45±0.10，1.20±0.08。統(tǒng)計結(jié)果顯示H-UA可明顯誘導(dǎo)Nrf2、HO-1mRNA表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而L-UA組可誘導(dǎo)Nrf2、HO-1mRNA表達(dá)增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義

12、。Nrf2核蛋白及HO-1蛋白的表達(dá)變化與基因水平改變類似。在Nrf2+/+小鼠中，再灌注24h后，Western-bloting的結(jié)果顯示，與Vehicle組相比，H-UA能夠明顯誘導(dǎo)Nrf2核蛋白、HO-1蛋白的表達(dá)，然而在Nrf2-/-小鼠中，H-UA的誘導(dǎo)能力被阻滯，而且神經(jīng)功能缺失更嚴(yán)重。
　　 結(jié)論：局灶性腦缺血再灌注后，缺血腦組織的MDA、Nrf2、HO-1水平存在一個相關(guān)性動態(tài)表達(dá)的變化過程，提示Nrf2/ARE

13、通路可能與抗氧化作用有一定相關(guān)性；UA對局灶性缺血再灌注腦損傷小鼠有確切的神經(jīng)保護(hù)作用，可改善腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能缺失，減小腦梗死體積，誘導(dǎo)Nrf2、HO-1的表達(dá)，減少MDA含量，因此我們推測UA的神經(jīng)保護(hù)可能是通過Nrf2/ARE通路的激活實現(xiàn)；而在Nrf2-/-小鼠腦缺血再灌注模型的觀察中，上述推測得到了進(jìn)一步證實，在Nrf2-/-小鼠模型中氧化損傷更明顯，UA的抗氧化作用被阻滯，說明Nrf2/ARE通路的激活是UA發(fā)揮其

14、抗氧化作用之一，從而實現(xiàn)其神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 第二部分熊果酸對局灶性腦缺血再灌注損傷小鼠的抗炎作用及其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究
　　 目的：觀察腦缺血再灌注損傷后不同時間點TLR4/NF-κB的活性變化，研究熊果酸對缺血再灌注小鼠的抗炎作用，探討熊果酸抗炎作用的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 方法：選用成年雄性CD-1小鼠、Nrf2-/-、Nrf2+/+小鼠為研究對象，采用改良線栓法制備大腦中動脈缺血再灌注模型。試驗1：

15、隨機(jī)將CD-1小鼠分為2組：假手術(shù)組(Sham)(n=30)，手術(shù)組(MCAO)，每組又根據(jù)不同的時間點分為3h、24h、48h、72h、7d五個亞組(n=90)。試驗2：隨機(jī)將CD-1小鼠分為4組：假手術(shù)組(Sham)、手術(shù)組(Vehicle)、小劑量熊果酸干預(yù)組(L-UA)(68mg/Kg)、大劑量熊果酸干預(yù)組(H-UA)(130mg/Kg)。試驗3：采用隨機(jī)的方法分別將Nrf2-/-、Nrf2+/+小鼠分為3組：假手術(shù)組(Sham

16、)、手術(shù)組(Vehicle)、大劑量熊果酸組(H-UA)(130mg/Kg)。Sham組：假手術(shù)后腹腔注射等量PBS+1％DMSO，Vehicle組：缺血再灌注術(shù)后腹腔注射等量PBS+1％DMSO，L-UA組：缺血再灌注術(shù)后腹腔注射熊果酸68mg/Kg，H-UA組：缺血再灌注術(shù)后腹腔注射熊果酸130mg/Kg。各組取材前進(jìn)行神經(jīng)功能評分，分別用RT-qPCR的方法和Western-bloting的方法檢測缺血腦組織中TLR4、NF-κB

17、mRNA和蛋白水平的變化。
　　 結(jié)果：在缺血再灌注早期TLR4、NF-κB的表達(dá)呈逐漸升高的趨勢，至24h達(dá)高峰，持續(xù)到48h，自72h開始逐漸下降。兩種劑量熊果酸干預(yù)后均可以降低腦缺血再灌注后小鼠的炎癥表達(dá)，TLR4/NF-κBmRNA表達(dá)以RQ值表示，Sham組、Vehicle組、L-UA組、H-UA組TLR4/NF-κB的RQ值分別為：0.40±0.31，1.69±0.09，1.20±0.13,1.00±0.26;0.5

18、0±0.04,1.52±0.25,1.30±0.09,0.96±0.40。統(tǒng)計結(jié)果顯示H-UA可明顯減輕TLR4/NF-κBmRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而L-UA組可減輕TLR4/NF-κBmRNA表達(dá)增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。TLR4、NF-κB核蛋白的表達(dá)變化與基因水平改變類似。在Nrf2+/+小鼠中，再灌注24h后，Western-bloting的結(jié)果顯示，與Vehicle組相比，H-UA能夠明顯抑制TLR4、NF-κB核蛋白

19、的表達(dá)，然而在Nrf2-/-小鼠中炎癥表達(dá)更嚴(yán)重，與Vehicle組相比，H-UA的抑制能力被阻滯。
　　 結(jié)論：局灶性腦缺血再灌注后，缺血腦組織的TLR4、NF-κB動態(tài)表達(dá)的變化過程與腦組織損傷程度一致，提示TLR4/NF-κB通路的炎癥損傷參與了腦缺血再灌注損傷；UA可下調(diào)TLR4、抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，從而減輕缺血再灌注后腦組織的過度炎癥反應(yīng)，實現(xiàn)缺血再灌注后的神經(jīng)保護(hù)作用；結(jié)合第一部分試驗結(jié)果，UA抑制TLR4/NF

20、-κB表達(dá)與誘導(dǎo)Nrf2/ARE表達(dá)上調(diào)，減少MDA含量存在一致性，故我們推測UA的抗炎作用可能是通過Nrf2/ARE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用，從而實現(xiàn)UA的抗氧化、抗炎的神經(jīng)保護(hù)作用；而在Nrf2-/-小鼠腦缺血再灌注模型的觀察中，上述推測得到進(jìn)一步證實，在Nrf2-/-小鼠模型中炎癥損傷更嚴(yán)重，UA的抗氧化、抗炎作用被阻滯，說明Nrf2/ARE通路激活是UA發(fā)揮其抗氧化、抗炎作用之一，從而實現(xiàn)其神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 第三部分熊果

21、酸對局灶性腦缺血再灌注損傷小鼠的促進(jìn)神經(jīng)分化作用及其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究
　　 目的：觀察腦缺血再灌注損傷后不同時間點神經(jīng)分化標(biāo)志物NF-M、NF-H、α-Tub的動態(tài)變化，研究熊果酸對缺血再灌注小鼠的促進(jìn)神經(jīng)分化作用，探討熊果酸促進(jìn)神經(jīng)分化作用的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 方法：選用成年雄性CD-1小鼠、Nrf2-/-、Nrf2+/+小鼠為研究對象，采用改良線栓法制備大腦中動脈缺血再灌注模型。試驗1：隨機(jī)將CD-1小鼠分

22、為2組：假手術(shù)組(Sham)(n=30)，手術(shù)組(MCAO)，每組又根據(jù)不同的時間點分為3h、24h、48h、72h、7d五個亞組(n=90)。試驗2：隨機(jī)將CD-1小鼠分為4組：假手術(shù)組(Sham)、手術(shù)組(Vehicle)、小劑量熊果酸組(L-UA)(68mg/Kg)(n=18)、大劑量熊果酸組(H-UA)(130mg/Kg)。試驗3：采用隨機(jī)的方法分別將Nrf2-/-、Nrf2+/+小鼠分為3組：假手術(shù)組(Sham)、手術(shù)組(Ve

23、hicle)、大劑量熊果酸組(H-UA)(130mg/Kg)。Sham組：假手術(shù)后腹腔注射等量PBS+1％DMSO，Vehicle組：缺血再灌注術(shù)后腹腔注射等量PBS+1％DMSO，L-UA組：缺血再灌注術(shù)后腹腔注射熊果酸68mg/Kg，H-UA組：缺血再灌注術(shù)后腹腔注射UA130mg/Kg。各組取材前進(jìn)行神經(jīng)功能評分，分別用RT-qPCR的方法和Western-bloting的方法檢測缺血腦組織NF-M、NF-H、α-TubmRNA和

24、蛋白水平的變化規(guī)律。
　　 結(jié)果：在缺血再灌注早期NF-M、NF-H、α-Tub的表達(dá)呈逐漸降低的趨勢，至24h達(dá)低谷，持續(xù)到72h，其中NF-M自第7d開始逐漸回升，而NF-H、α-Tub表達(dá)無明顯回升。兩種劑量熊果酸干預(yù)后均可以上調(diào)腦缺血再灌注后小鼠的NF-M表達(dá)，而對NF-H、α-Tub的表達(dá)無明顯影響。NF-M、NF-H、α-TubmRNA表達(dá)以RQ值表示，Sham組、Vehicle組、L-UA組、H-UA組NF-M、N

25、F-H、α-Tub的RQ值分別為：NF-M1.80±0.53，0.76±0.10，0.85±0.03，1.02±0.26;NF-H1.50±0.14,0.41±0.05,0.42±0.19,0.48±0.05：α-Tubl.50±0.14,0.58±0.05，0.52±0.03，0.56±0.04。統(tǒng)計結(jié)果顯示H-UA可明顯上調(diào)NF-MmRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而L-UA組可上調(diào)NF-MmRNA表達(dá)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。兩種劑量熊

26、果酸干預(yù)后對NF-H、α-Tub的表達(dá)無明顯影響。NF-M、NF-H、α-Tub蛋白的表達(dá)變化與基因水平改變類似。在Nrf2+/+小鼠中，再灌注24h后，Western-bloting的結(jié)果顯示，與Vehicle組相比，H-UA能夠明顯誘導(dǎo)NF-M蛋白的表達(dá)，然而在Nrf2-/-小鼠中，H-UA的誘導(dǎo)能力被阻滯。
　　 結(jié)論：局灶性腦缺血再灌注后，缺血腦組織中NF-M、NF-H、α-Tub動態(tài)表達(dá)的變化過程與腦組織損傷程度一致；

27、UA可上調(diào)NF-M的表達(dá)，而NF-H、α-Tub表達(dá)未受影響，可能與NF-M主要出現(xiàn)在神經(jīng)分化的早期，而NF-H主要出現(xiàn)在神經(jīng)分化的晚期有關(guān)；結(jié)合第一部分試驗結(jié)果，UA促進(jìn)NF-M表達(dá)與誘導(dǎo)Nrf2/ARE表達(dá)上調(diào)存在一致性，故我們推測熊果酸的促進(jìn)神經(jīng)分化作用可能是通過Nrf2/ARE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用，從而實現(xiàn)UA的促神經(jīng)分化的神經(jīng)保護(hù)作用；而在Nrf2-/-小鼠腦缺血再灌注模型的研究中，上述推測得到進(jìn)一步證實，在Nrf2-/-小鼠