1、本文研究目的：通過經(jīng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的混合培養(yǎng)，分析比較脂肪細(xì)胞是否能夠抑制成纖維細(xì)胞的增殖及膠原合成，并分析和比較脂肪細(xì)胞本身的變化。 研究方法：3T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化；成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)取第4～6代細(xì)胞進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)分三組，AF組：脂肪細(xì)胞與成纖維細(xì)胞混合培養(yǎng)組；A組：?jiǎn)渭冎炯?xì)胞培養(yǎng)組；F組：?jiǎn)渭兂衫w維細(xì)胞培養(yǎng)組。每組各實(shí)驗(yàn)均測(cè)3個(gè)數(shù)值，取平均值。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：將細(xì)

2、胞分別于原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞傳代48小時(shí)后、3T3-L1接種時(shí)、3T3-L1誘導(dǎo)分化第8天、誘導(dǎo)分化油紅0染色后在倒置相差顯微鏡下直接觀察細(xì)胞的形態(tài)并攝像。細(xì)胞計(jì)數(shù)及生長(zhǎng)曲線的繪制：取生長(zhǎng)狀況良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，分3組接種，AF組：分別將脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞以1×105/2ml培養(yǎng)液接種于25ml，底面積為12cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每組3瓶；A組：將脂肪細(xì)胞以1×105/4ml培養(yǎng)液接種于上述培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每組3瓶；F組：將成纖維

3、細(xì)胞以1×105/4ml培養(yǎng)液接種于上述培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每組3瓶。連續(xù)培養(yǎng)12天，每天均取3瓶細(xì)胞行苔盼藍(lán)染色排除法活細(xì)胞計(jì)數(shù)，其中AF組采用密度梯度離心，Percoll細(xì)胞分離液分離細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀測(cè)脂肪細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的百分比，計(jì)算純度后計(jì)數(shù)，每瓶重復(fù)計(jì)數(shù)三次，取平均值，繪制生長(zhǎng)曲線。膠原合成的測(cè)定：取生長(zhǎng)狀況良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，分兩組接種：AF組：分別將脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板，共3小

4、組，每組5孔；F組：將成纖維細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板，共3小組，每組5孔。分別于培養(yǎng)1、3、5、7、9天后，取一組細(xì)胞上清液0.5mL,加無水乙醇1.2mL,旋渦混勻器充分混勻2min×2次，3500r/min離心10min，取上清(約1.5mL)，烘干，加0.5mL雙蒸水復(fù)溶，制成稀釋倍數(shù)為1的檢測(cè)液，加試劑1、2、3(具體操作按羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒說明書)，混勻，65℃水浴15min，冷卻，550nm，1cm光徑，水調(diào)零，

5、比色。羥脯氨酸(mg/L)=(測(cè)定管吸光度值-空白管吸光度值)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值-空白管吸光度值)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度×稀釋倍數(shù)。膠原蛋白(μg)=羥脯氨酸÷13.4﹪，每次測(cè)3組，取平均值。油紅O染色提取法測(cè)定脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪含量：同細(xì)胞計(jì)數(shù)方法接種細(xì)胞，AF組、A組，每組3小組，各5瓶，細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)9天，于1、3、5、7、9天各取一組細(xì)胞，根據(jù)Ramirez等方法測(cè)定：將AF組、A組細(xì)胞用體積分?jǐn)?shù)10﹪甲醛的等滲鹽緩沖液固定1h，蒸餾水漂洗。

6、吸取油紅O工作液10mL，使培養(yǎng)面向下浸染，2h后倒掉瓶?jī)?nèi)的油紅O工作液，蒸餾水漂洗培養(yǎng)瓶數(shù)次，直至完全漂洗干凈。將已染色的培養(yǎng)瓶置于32℃孵箱內(nèi)蒸發(fā)掉瓶?jī)?nèi)的水份后即加入1mL異丙醇，萃取出的染液立即用吸管移出，于722型分光光度計(jì)510nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以O(shè)D值表示，每次測(cè)3組，取平均值。 研究結(jié)果：在4～12天時(shí)，AF組成纖維細(xì)胞數(shù)量少于F組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在5、11、12天時(shí)AF組脂肪細(xì)胞少于A組，且