1、第一部分人蛋白激酶Cβ2基因開放讀碼框的克隆及序列分析 目的：克隆人蛋白激酶Cβ2基因(PRKCBl)的開放讀碼框(ORF)，為其進一步的功能研究提供基礎。 方法：采用逆轉錄-巢式PCR法，從人臍靜脈內皮細胞株中擴增出含PRKCBl基因ORF全長的片段，所得片段經加“A”處理并插入T載體。經藍白篩選，用特異引物擴增陽性重組子，得到編碼人蛋白激酶Cβ2(PKCβ2)基因的ORF，并與T載體相連，測序鑒定。 結果：通

2、過巢式RT-PCR及T/A克隆獲取了PRKCB1基因的ORF，測序結果與GenBank報道序列一致。 結論：成功克隆了PRKCB1基因的ORF，在技術路線上可以為某些難克隆的基因提供參考。 第二部分攜帶增強綠色熒光蛋白基因的人 PRKCB1真核表達載體的構建及轉染 目的：構建攜帶增強綠色熒光蛋白基因的人PRKCB1真核表達載體并轉染人臍靜脈內皮細胞。 方法：從已構建且測序正確的pMD18-T-PRKCB1

3、質粒中，擴增出人PRKCB1并與帶有增強型綠色熒光蛋白的真核表達載體pReceiver-M29酶切后連接、轉化，所獲重組體酶切鑒定及測序。按優(yōu)化的轉染參數，將pReceiver-M29-PRKCB1轉染人臍靜脈內皮細胞，熒光顯微鏡觀察熒光蛋白表達，隨機視野下計算轉染效率。 結果：構建的pReceiver-M29-PRKCB1質粒測序與 GenBank公布的序列一致。轉染后48小時，熒光蛋白表達最佳，轉染率為18.62％。

4、 結論：成功構建了pReceiver-M29-PRKCB1真核表達質粒并轉染人臍靜脈內皮細胞，觀察到綠色熒光蛋白表達，為篩選穩(wěn)定表達人蛋白激酶Cβ2的內皮細胞株，及其蛋白復合體分離提供分子工具。 第三部分應用Cre/IoxP系統(tǒng)構建人蛋白激酶Cβ2重組腺病毒載體及鑒定 目的：構建人蛋白激酶 Cβ2重組腺病毒載體，為蛋白組學研究提供分子工具。 方法：從pMD18-T-PRKCB1質粒中，擴增出人PRKCB1。所得片

5、段定向克隆至穿梭質粒pDC315上，然后與骨架質粒pBHG10x△E1，3Cre共轉染293細胞，經同源重組構建腺病毒Ad-PRKCB1，測定重組病毒的滴度，通過免疫細胞化學和RT-PCR方法進行鑒定。 結果：酶切及PCR表明目的基因正確插入穿梭質粒。同源重組后，倒置顯微鏡下可見細胞病變效應，病毒包裝成功。擴增純化后病毒滴度為7.9×10°IU/ml。RNA及蛋白質水平鑒定顯示目的片段有效表達。 結論：成功構建了含人蛋白