1、β-淀粉樣蛋白對(duì)癲癇發(fā)作影響的研究。β-淀粉樣蛋白(p-amyloid protein，Aβ)是Alzheimer Disease(AD)腦內(nèi)特征性病理改變一老年斑(senile plaques，SP)的主要成分[1]。Aβ具有對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。高濃度的，或聚集狀態(tài)Aβ被認(rèn)為具有神經(jīng)毒性作用。癲癇是一種常見(jiàn)的腦部疾病，其特征為腦神經(jīng)元過(guò)度放電所致的反復(fù)癇樣發(fā)作。一些臨床資料顯示顳葉癲癇(temporal lobe epilep

2、sy，TLE)病人的腦內(nèi)可以檢測(cè)到明顯的SP，提示TLE對(duì)SP的形成有重要影響。SP的形成和癲癇發(fā)作之間的關(guān)系目前還不明了，作為SP的主要成分-Aβ可能參與加重或減輕癲癇的發(fā)作。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Aβ對(duì)癲癇發(fā)作的可能影響進(jìn)行了初步研究。主要研究結(jié)果如下： 1.動(dòng)物癲癇模型采用Wistar大鼠海人藻酸(Kalnic Acid，KA)(1μg/μ1，1μ1)側(cè)腦室注射。用免疫組織化學(xué)染色，免疫熒光化學(xué)方法觀察癲癇病人癲癇灶組織內(nèi)Aβ以及癲癇動(dòng)

3、物腦內(nèi)β淀粉樣蛋白前體(Amyloid precursor protein，APP)、Aβ的分布情況。結(jié)果顯示：癲癇病人癲癇硬化灶內(nèi)有Aβ的點(diǎn)狀分布。Wistar大鼠KA致癇6小時(shí)后，免疫組織化學(xué)染色海馬、皮層Aβx-40免疫陽(yáng)性物質(zhì)明顯較正常組增多；免疫熒光檢測(cè)Aβx-42，同樣見(jiàn)致癇大鼠腦內(nèi)海馬陽(yáng)性物質(zhì)增加。另外，分別用APP-N抗體和APP-C抗體檢測(cè)顯示KA致癇大鼠腦內(nèi)APP有增加，以海馬和皮層增加明顯。 2.從mRNA

4、水平觀察KA致癇大鼠腦內(nèi)APP基因表達(dá)情況，以及其它神經(jīng)元退行性相關(guān)蛋白-tau蛋白的基因表達(dá)，并探索可能參與APP、tau基因剪接有關(guān)機(jī)制。用RT-PCR方法檢測(cè)的結(jié)果顯示：KA致癇6h后，海馬內(nèi)APPmRNA表達(dá)增加，易產(chǎn)生Aβ的APP異型體APP751和APP770的比例增加。對(duì)tau mRNA的5'和3'端檢測(cè)顯示tau表達(dá)在致癇6h后也明顯增加，并且有5’端發(fā)生剪輯的改變。另外剪接因子tra2β，NSSRl在KA致癇的誘導(dǎo)下也

5、有明顯增加。以上結(jié)果提示：癲癇發(fā)作可以促進(jìn)腦內(nèi)APP表達(dá)，同時(shí)癲癇可影響中樞mRNA剪輯機(jī)制，導(dǎo)致易產(chǎn)生Aβ的APP異型體增加，促進(jìn)Ap產(chǎn)生增加。 3.為了觀察Aβ對(duì)癲癇發(fā)作的影響，用側(cè)腦室注射不同劑量的可溶性單體Aβ1-40(0.004nmo1，0.04nmo1，0.4nmo1)干預(yù)KA誘發(fā)的癲癇。通過(guò)對(duì)大鼠癲癇發(fā)作行為學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)預(yù)先給予可溶的單體Aβ1-40，大鼠癲癇發(fā)作潛伏期延長(zhǎng)，發(fā)作強(qiáng)度也有一定程度減弱，以0.04nm

6、o1劑量較為明顯。 4.觀察了大鼠側(cè)腦室注射不同劑量可溶的單體Aβ1-40對(duì)KA致癇大鼠大腦皮層腦電的影響。大鼠腦內(nèi)注射KA后30～40min即在皮層記錄到癇樣放電，表現(xiàn)為典型的單個(gè)棘波、尖波和棘慢波，以及短暫的，爆發(fā)性的多棘慢波或不規(guī)則棘慢波。而給與Aβ1-40后，這種棘慢波明顯減少，平均腦電總功率也降低，抑制效果以0.04nmo1的Aβ1-40較為明顯。通過(guò)腦電記錄進(jìn)一步說(shuō)明可溶性Aβ1-40單體對(duì)KA誘導(dǎo)癲癇發(fā)作有一定的抑制作用。

7、 5.在體外，新生6天SD大鼠海馬腦片上用picrotoxin(20μM)誘導(dǎo)癇樣放電。細(xì)胞外場(chǎng)點(diǎn)位記錄顯示，灌流10min左右即可記錄到持續(xù)的癇樣放電，置換灌流液，用含2nmo1 Aβ1-40的picrotoxin人工腦脊液灌流，2min后癇樣放電明顯被抑制，再用含picrotoxin人工腦脊液沖洗，再次出現(xiàn)癇樣放電。說(shuō)明在體外Aβ也能抑制海馬腦片癇樣放電。 6.觀察Aβ1-40對(duì)KA致癇引起神經(jīng)元損傷的影響，外源性地

8、給與不同劑量的可溶的單體Aβ1-40(0.004nmo1，0.04nmo1，0.4nmo1)側(cè)腦室注射，再同側(cè)側(cè)腦室注射KA(1ug)。焦油紫(cresyl violet，CV)染色和Fluoro-JadeB染色均提示Aβ1-40可減少海馬神經(jīng)元損傷。結(jié)果提示，外源性給予的一定劑量的可溶性單體Aβ1-40可抑制KA誘導(dǎo)的興奮性毒性對(duì)神經(jīng)元的損害。 7.為進(jìn)一步觀察內(nèi)源性的Aβ對(duì)癲癇發(fā)作是否有影響，我們給予大鼠側(cè)腦室注射γ分泌酶抑

9、制劑(13.5μM，2μ1)，抑制APP水解產(chǎn)生Aβ，再同側(cè)側(cè)腦室注射致癇劑量的KA。行為學(xué)觀察結(jié)果和單純KA致癇組沒(méi)有顯著差別，但CV染色和Fluoro-Jade B染色顯示海馬神經(jīng)元損害較單純KA組嚴(yán)重，從而進(jìn)一步提示內(nèi)源性的Aβ也有一定抑制KA誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作及其導(dǎo)致的神經(jīng)元損害的作用。 8.由于各種致癇刺激可促進(jìn)c-fos迅速表達(dá)，根據(jù)FOS蛋白在致癇刺激后的表達(dá)程度的高低可判斷藥物或其它相關(guān)因素在治療或致癇作用中的大小。

10、我們采用免疫組化的方法觀察了給予不同處理后的大鼠腦內(nèi)FOS蛋白的分布情況。結(jié)果顯示，在單純KA致癇組腦內(nèi)海馬、梨狀皮層、杏仁核這些與癲癇發(fā)作密切相關(guān)的部位的FOS蛋白均較正常對(duì)照組顯著增加。KA誘導(dǎo)致癇前預(yù)先側(cè)腦室注射γ分泌酶抑制劑抑制(13.5μM，2μ1)Aβ的產(chǎn)生，導(dǎo)致動(dòng)物的梨狀皮層、杏仁核部位較單純KA組明顯增加；預(yù)先給予0.04nmo1的可溶性Aβ可抑制各腦區(qū)KA誘導(dǎo)的FOS蛋白表達(dá)的增加。提示適當(dāng)劑量的可溶的Aβ可抑制KA的

11、興奮毒性作用。 9.為觀察纖維狀或高劑量的Aβ對(duì)KA誘導(dǎo)癲癇的腦損害，預(yù)先給Wistar大鼠側(cè)腦室內(nèi)注射高劑量的Aβ(0.4μmo1)或海馬內(nèi)注射纖維狀A(yù)β(0.4μmo1)，再同側(cè)側(cè)腦室注射KA(0.4μ1，1μg/μ1)。CV染色和Fluoro-JadeB染色顯示纖維狀A(yù)β和高劑量的Aβ均加重了KA誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元的損害。這可能提示為什么AD病人是老年癲癇的高危人群[3]。 10.初步探討可溶性單體Aβ對(duì)癲癇抑制作用

12、的可能機(jī)制。用免疫組織化學(xué)方法觀察到癲癇發(fā)作6h時(shí)，Munc-18蛋白水平表達(dá)下降，而預(yù)先給予Aβ再誘發(fā)癲癇組Munc-18蛋白表達(dá)較正常組變化不明顯，由于Munc-18對(duì)遞質(zhì)釋放有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，說(shuō)明AD可能通過(guò)影響Munc-18的表達(dá)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。 綜上所述，癲癇病人以及海人藻酸(KA)誘導(dǎo)致癇大鼠腦內(nèi)有Aβ的增加，Aβ的增加與KA致癇導(dǎo)致的APP表達(dá)上調(diào)有關(guān)。一定劑量的可溶性單體Aβ1-40可抑制動(dòng)物KA誘導(dǎo)的癲癇的發(fā)