1、背景與目的:近半個世紀以來世界上許多國家和地區(qū)，肺癌的發(fā)病率和死亡率均持續(xù)上升，成為威脅人類生命健康最大的惡性腫瘤。侵襲轉(zhuǎn)移是肺癌的惡性標志和特征，也是導致患者治療失敗和死亡的主要原因。肺癌侵襲轉(zhuǎn)移是一個多基因和多步驟發(fā)展過程，可涉及細胞多個信號通路的改變，正是由于某些細胞信號傳導通路中的關(guān)鍵基因結(jié)構(gòu)或功能異常，激活或抑制了細胞中相關(guān)信號傳導通路，導致了肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移表型的表達。nm23-H1是肺癌的轉(zhuǎn)移抑制基因，在調(diào)節(jié)肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的過

2、程中，對調(diào)控與“肺癌轉(zhuǎn)移抑制級聯(lián)”相關(guān)的一系列下游基因具有重要的作用。Ras-to-MAPK信號傳導通路普遍存在，在許多生長和發(fā)育信號傳遞中起關(guān)鍵的作用，并且通過Ras激活一系列細胞質(zhì)激酶Raf，MEK和MAPK并傳遞信號。在Ras-to-MAPK通路中Ras激酶抑制基因(KSR)是在1995年發(fā)現(xiàn)的一個新基因，其功能是作為支架蛋白為組裝Ras下游關(guān)鍵信號形成多蛋白復合體提供一個可利用的磷酸化反應支架，從而加速MAPK通路的信號傳導。周

3、清華教授為首的課題組前期研究探討了nm23-H1與KSR相互作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)nm23-H1磷酸化KSR和KSR氨基端，而不磷酸化其羧基端。證實nm23-H1具有組氨酸激酶活性，從而推測nm23-H1可通過改變支架蛋白KSR的磷酸化狀態(tài)影響Ras-to-MAPK通路的信號傳導。目前尚不能確定nm23-H1基因調(diào)控KSR的分子靶點，以及nm23-H1與突變后KSR相互作用對nm23-H1調(diào)控肺癌轉(zhuǎn)移有何影響?因此通過應用基因重組技術(shù)構(gòu)建不同K

4、SR片斷，研究不同KSR片斷與nm23-H1蛋白相互作用關(guān)系；根據(jù)nm23-H1蛋白磷酸化KSR片斷的位置不同，應用定點突變技術(shù)選擇可能的KSR磷酸化位點，在已知KSR基因DNA序列中準確地取代該位點堿基獲得突變體蛋白質(zhì)，研究突變后KSR蛋白與nm23-H1蛋白相互作用關(guān)系，為進一步闡明“肺癌轉(zhuǎn)移抑制級聯(lián)”的分子機制提供理論基礎和試驗依據(jù)。 材料與方法:(1)．應用本實驗室構(gòu)建的pET28a-nm23-H1表達載體，表達nm23

5、-H1蛋白，應用親和層析的方法純化蛋白，以及Western blot和放射自顯影的方法研究nm23-H1蛋白的生物學活性；(2)．應用基因重組技術(shù)從pCMV-Tag2b-KSR載體上構(gòu)建出pCMV-Tag2b-N-296-KSR真核表達載體，測序驗證結(jié)果。將pCMV-Tag2b-KSR、pCMV-Tag2b-N-KSR，pCMV-Tag2b-N-296-KSR和pCMV-Tag2b-C-KSR四種真核表達載體轉(zhuǎn)染293T、細胞，獲得：K

6、SR，N-KSR，N-296-KSR和C-KSR融合蛋白，可以通過Westernblot鑒定目的蛋白。體外激酶活性分析自磷酸化的nm23-H1蛋白與不同長度KSR、N-296-KSR，N-KSR和C-KSR之間磷酸化的關(guān)系；(3)．應用本實驗室改進的定點突變技術(shù)分別構(gòu)建了全長6950bp pCMV-Tag2b-KSR氨基端9個位點，并瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞株表達蛋白；(4)．應用親和膠純化KSR突變蛋白，應用體外激酶活性實驗方法檢測野生型

7、自磷酸化nm23-H1與KSR突變體蛋白是否發(fā)生相互作用，從而尋找可能的nm23-H1磷酸化KSR位點。 結(jié)果:本研究觀察到：(1)本研究成功將本實驗室構(gòu)建的pET28a-nrn23-H1原核表達載體表達出了原核蛋白，應用親和層析的方法純化nm23-H1蛋白，用放射自顯影的方法證實原核表達蛋白具有自身磷酸化生物學活性并且表達的目的蛋白能夠通過Western blot鑒定。(2)本研究從pCMV-Tag2b-KSR載體上成功構(gòu)建出

8、pCMV-Tag2b-KSR-296片段真核表達載體；并成功地將其真核表達載體轉(zhuǎn)染293T細胞，獲得FLAG-N-KSR-296片段融合蛋白，目的蛋白可以通過Westem blot鑒定。(3)體外激酶活性實驗發(fā)現(xiàn)，自磷酸化的nm23-H1不能磷酸化N-296-KSR和羧基端，據(jù)此可以推測nm23-H1磷酸化KSR在N-296和N-538之間，這個位置主要集中在KSR的CA3、CA4區(qū)域之間。(4)本研究應用改良的QuikChange<'

9、TM>方法進行定點突變，成功構(gòu)建了9個突變型pCMV-Tag2b-KSR質(zhì)粒：pCMV-Tag2b-KSR<'S297A>、pCMV-Tag2b-KSR<'S392A>、pCMV-Tag2b-KSR<'A431A>、pCMV-Tag2b-KSR<,S434A>、pCMV-Tag2b-KSRS|<'S435A>、pCMV-Tag2b-KSR<'S438A>、pCMV-Tag2b-KSR<,S439A>、pCMV-Tag2b-KSR|<'S

10、442A>，pCMV-Tag2b-KSR<'S443A>。經(jīng)DNA測序證實。瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞轉(zhuǎn)染出目的蛋白、純化后并進行westem blot檢測鑒定。(5)體外激酶活性實驗發(fā)現(xiàn)：自磷酸化的nm23-H1與KSR突變體蛋白發(fā)生作用，在FLAG-KSR<'S297A>、FLAG-KSR<'S392A>、FLAG-KSR<'S431A>、FLAG-KSR<'S435A>、FLAG-KSR<'S438A>、FLAG-KSR<'S442A>

11、，F(xiàn)LAG-KSR<'S443A>8個突變體放射自顯影圖中可見有磷酸化條帶，而FLAG-KSR<'S439A>突變蛋白沒有出現(xiàn)磷酸化條帶，F(xiàn)LAG-KSR<'S434A>、FLAG-KSR<'S297A>可以被磷酸化，但是磷酸化條帶很弱，該結(jié)果說明發(fā)生突變的KSR絲氨酸297、392、431、435、438、442、443位點不是nm23-H1磷酸化位點，而絲氨酸439位點是nm23-H1磷酸化位點。 結(jié)論:(1)成功表達出具有

12、活性的野生型nm23-H1蛋白；(2)成功構(gòu)建pCMV-Tag2b-KSR-N-296片段真核表達載體，并獲得該片段融合蛋白；(3)成功構(gòu)建pCMV-Tag2b-KSR氨基端9個突變位點真核表達載體獲得9個突變體蛋白：FLAG-KSR<'S297A>、FLAG-KSR<'S392A>、FLAG-KSR<'S431A>、FLAG-KSR<'S434A>、FLAG-KSR<'S435A>、FLAG-KSR<'S438A>、FLAG-KSR<

13、'S439A>、FLAG-KSR<'S442A>，F(xiàn)LAG-KSR<'S443A>；(4)證實自磷酸化的nm23-H1可以磷酸化KSR，它們之間存在磷酸化關(guān)系，在研究發(fā)現(xiàn)9個突變體蛋白中除KSR<'S439A>未發(fā)生磷酸化以外，其它8個蛋白均發(fā)生了磷酸化反應，據(jù)此推測nm23-H1調(diào)控KSR的分子靶點可能位于KSR氨基端的絲氨酸439位點，nm23-H1可影響KSR磷酸化水平，nm23-H1抑制肺癌轉(zhuǎn)移的機理可能與KSR的磷酸化功能狀態(tài)