1、為了闡明KLF4是否可以募集p300并進而介導組蛋白乙?；约捌浞肿訖C制，本研究用轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）誘導VSMC分化，探索KLF4與p300、PTEN等蛋白因子相互作用及其翻譯后修飾的變化，研究KLF4與組蛋白乙?；g的關(guān)系，從表觀遺傳學角度揭示VSMC表型調(diào)制及分化的新機制。
　　第一部分 KLF4介導TGF-β1誘導的組蛋白H3乙?；?br>　　目的:觀

2、察TGF-β1是否促進組蛋白乙?；约癒LF4在組蛋白乙?；兴鸬淖饔谩?br>　　方法:Western blot檢測組蛋白H3和H4的乙?；?細胞免疫熒光觀察TGF-β1對組蛋白H3和H4乙?；挠绊?ChIP法檢測乙?；疕3、p300和KLF4在p21、TβRI啟動子上的富集。
　　結(jié)果:1.組蛋白乙?；c基因轉(zhuǎn)錄激活密切相關(guān)，TGF-β1調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞分化和細胞周期相關(guān)基因的表達。
　　2.過表達KLF4后，組

3、蛋白H3的乙酰化水平明顯升高，TGF-β1處理進一步促進H3的乙酰化。敲低內(nèi)源性KLF4后，組蛋白H3的乙酰化水平降低，TGF-β1對H3的乙?；讲辉佼a(chǎn)生影響;但組蛋白H4的乙?；讲皇躃LF4過表達或敲低的影響。結(jié)果表明，KLF4是TGF-β1誘導組蛋白乙?；仨毜?。
　　3.在過表達KLF4的細胞中，乙?；虷3水平在1.5 kb的p21啟動子區(qū)域均有不同程度的增高，但以-645bp到+57 bp區(qū)域乙?；虷3富集較

4、為明顯，-227bp/+57 bp區(qū)域乙?；虷3的富集程度最大。這一區(qū)域含有KLF4的結(jié)合位點。在敲低KLF4的細胞中，該區(qū)域乙?；虷3的富集程度降低。這些結(jié)果表明，KLF4介導組蛋白H3的乙酰化并促進乙?；疕3在p21啟動子區(qū)域的富集。
　　4.TGF-β1增強p300在p21啟動子區(qū)域的結(jié)合，其結(jié)合位點主要定位于-645 bp/-397 bp和-225 bp/57 bp區(qū)域，這兩個區(qū)域分別包含Smad和KLF4的結(jié)合位點。

5、進一步研究發(fā)現(xiàn)，p300結(jié)合受KLF4的調(diào)節(jié)，在過表達KLF4的基礎(chǔ)上，再用TGF-β1刺激細胞12 h，p300在這兩個區(qū)域的結(jié)合進一步增加。靶向敲低KLF4后，p300在此區(qū)域的富集降低。
　　結(jié)論:KLF4可以將p300募集到VSMC分化相關(guān)基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點上，并促進TGF-β1誘導的組蛋白H3乙?；?。
　　第二部分 p300、PTEN通過與KLF4相互作用，影響其乙?；傲姿峄?br>　　目的:檢測TGF

6、-β1是否影響KLF4與乙?；竝300、磷酸酶PTEN的相互作用。觀察p300、PTEN對KLF4修飾狀態(tài)的影響。
　　方法:免疫共沉淀檢測KLF4與p300、PTEN的相互作用;細胞免疫熒光觀察TGF-β1是否誘導KLF4和p300入核;Sequential-ChIP法檢測p300和KLF4在p21啟動子上的結(jié)合方式;GST pull-down體外驗證KLF4與p300、PTEN的相互作用。
　　結(jié)論:在基礎(chǔ)水平上，PT

7、EN與KLF4形成復合物抑制KLF4的磷酸化，TGF-β1刺激后，PTEN與KLF4解離，PTEN不再能去磷酸化KLF4，進而KLF4轉(zhuǎn)為與p300相互作用，將募集p300到p21等分化相關(guān)基因的啟動子KLF4結(jié)合位點上。
　　第三部分 磷酸化型KLF4通過p38信號通路影響p300乙酰化，進而介導組蛋白H3乙酰化
　　目的:研究KLF4的磷酸化修飾是否參與組蛋白H3的乙?；白饔脵C制。
　　方法:轉(zhuǎn)染KLF4磷酸化、

8、乙酰化位點突變體表達質(zhì)粒，觀察與KLF4相互作用的相關(guān)蛋白的修飾狀態(tài)的改變;Western blot檢測相關(guān)信號通路的變化;siRNA轉(zhuǎn)染實驗用于在VSMC中敲低KLF4;免疫沉淀實驗檢測KLF4磷酸化和乙酰化狀態(tài)的變化。
　　結(jié)果:1.KLF4磷酸化影響其與p300的相互作用及自身的乙?；?br>　　VSMC被TGF-β1刺激后，KLF4發(fā)生磷酸化在前，乙酰化在后;磷酸化型KLF4影響KLF4與p300相互作用，但不影響KLF4

9、與PTEN的相互作用，這意味著KLF4與PTEN的解離在先，KLF4與p300相互作用在后。
　　2.KLF4的磷酸化影響組蛋白H3乙酰化
　　上述結(jié)果顯示，過表達KLF4可增加組蛋白H3的乙酰化水平，那么是否KLF4的磷酸化也影響組蛋白乙酰化呢？我們分別用KLF4(WT)、KLF4(S470A)、KLF4(K225R)、KLF4(K229R)和KLF4(K225/229R)表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，Western blot分析結(jié)果

10、顯示，轉(zhuǎn)染KLF4(WT)后，給予TGF-β1孵育12 h，組蛋白H3的乙?；矫黠@增高，在KLF4(S470A)轉(zhuǎn)染+TGF-β1處理的細胞中，乙?；虷3水平明顯降低。但是KLF4(K225R)+TGF-β1、KLF4(K229R)+TGF-β1和KLF4(K225/229R)+TGF-β1組的乙酰化水平?jīng)]有受到影響。我們也檢測了p300對組蛋白H3乙?；挠绊?，用p300乙?；敢种苿〨arcinol孵育細胞后，乙?；虷3水平

11、顯著降低。這些結(jié)果表明，KLF4磷酸化對組蛋白H3乙?；挠绊懞苡锌赡苁峭ㄟ^募集p300來實現(xiàn)的的。
　　3.KLF4磷酸化影響p300乙?；?br>　　Western blot分析結(jié)果顯示，TGF-β1作用于細胞15 min，PTEN的磷酸化顯著增加，在30 min達到高峰，60 min后PTEN的磷酸化恢復到基礎(chǔ)水平，與KLF4的磷酸化變化趨勢一致。在相同實驗條件下，我們也檢測了p300乙酰化修飾狀態(tài)的變化。結(jié)果顯示，TGF-

12、β1刺激使p300乙酰化水平呈時間依賴性增加，與KLF4的乙?；兓厔菀恢隆Ｄ敲碖LF4磷酸化是否影響p300乙?；兀哭D(zhuǎn)染KLF4(WT)后，給予TGF-β1孵育30 min，PTEN的磷酸化和p300乙?；骄龈?，KLF4(S470A)+TGF-β1使p300的乙?；矫黠@降低，對PTEN的磷酸化沒有影響。而KLF4(K225R)+TGF-β1、KLF4(K229R)+TGF-β1和KLF4(K225/229R)+TGF-β

13、1處理對p300乙?；瘺]有影響。可見，KLF4的磷酸化會正反饋調(diào)節(jié)p300的乙?；?。
　　4.Smad和p38信號通路影響p300與KLF4的修飾狀態(tài)
　　我們進一步檢測了TGF-β1對有關(guān)信號通路的影響。用TGF-β1刺激給予VSMC不同時間(0、15、30、45、60 min)，提取總蛋白進行Western blot分析。結(jié)果顯示，TGF-β1可以誘導p38、JNK、Smad2和Akt的快速磷酸化，而ERK的磷酸化水

14、平降低。同時，而各組細胞中p38、JNK、Smad2、Akt和ERK的總量沒有發(fā)生變化。在給予TGF-β1處理細胞之前，用上述信號通路的特異性抑制劑預孵育細胞2h，經(jīng)免疫沉淀和Western blot分析各蛋白的翻譯后修飾狀態(tài)的改變。結(jié)果顯示，TGF-β1通過p38 MAPK和Akt信號通路影響PTEN的磷酸化;通過Smad和p38 MAPK信號通路影響KLF4的磷酸化、乙?；蚿300的乙酰化。證實TGF-β1通過Smad和p38 M

15、APK信號通路誘導KLF4磷酸化是p300乙?；匦璧?。
　　5.KLF4通過p38信號通路影響p300乙?；?br>　　我們也檢測了KLF4影響p300乙?；男盘柾?。Western blot結(jié)果顯示，KLF4過表達可增加p38的磷酸化，但是不影響Smad的磷酸化水平。敲低KLF4可以部分抑制p38的磷酸化。這就從正反兩方面證明了，KLF4可能通過p38信號通路促進p300的乙?；?br>　　結(jié)論:TGF-β1通過激活p3

16、8和Smad信號通路誘導KLF4磷酸化，進而促進KLF4與p300相互作用及KLF4乙?；?。同時，KLF4也可通過間接激活p38信號通路誘導p300乙酰化，進而促進組蛋白H3的乙?；?br>　　結(jié)論:1.KLF4可以將p300募集到VSMC分化相關(guān)基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點上，并促進介導TGF-β1誘導的組蛋白H3乙?；?br>　　2.在基礎(chǔ)水平上，PTEN與KLF4形成復合物抑制KLF4的磷酸化，TGF-β1刺激后，PTEN與K