1、目的：完善大鼠精原干細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)技術(shù)；研究c-raf對(duì)精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)的存活作用及機(jī)制。 方法：非連續(xù)密度梯度離心及差速貼壁法分離精原干細(xì)胞；c-kit細(xì)胞免疫組織化學(xué)鑒定精原干細(xì)胞；基因測(cè)序和SeqMan、檢驗(yàn)精原干細(xì)胞擴(kuò)增DNA和c-raf的同源性；MTT比色法檢測(cè)體外培養(yǎng)精原干細(xì)胞的存活及增殖情況，觀察c-raf AON對(duì)精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)存活的量效關(guān)系及c-raf AON對(duì)精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)存活的時(shí)效關(guān)系；RT

2、-PCR檢測(cè)c-raf mRNA和caspasc-3 mRNA的表達(dá)情況；TUNEL檢測(cè)c-raf，AON對(duì)精原干細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果：非連續(xù)密度梯度離心及差速貼壁法分離的精原干細(xì)胞，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)其存活率分別為92.3％和91.5％；分離后的精原干細(xì)胞經(jīng)c—kit鑒定其純度為90.1％；精原干細(xì)胞在含10％NBS的DMEM中培養(yǎng)120h時(shí)增殖達(dá)高峰，在無10％NBS的DMEM中培養(yǎng)其存活率持續(xù)下降；精原干細(xì)胞擴(kuò)增DNA和c

3、-raf的同源性為98％；15μmol/L c-raf AON作用12h后精原干細(xì)胞存活率下降(P＜0.05)。于18h后存活率持續(xù)下降(P＜0.05)；與對(duì)照組相比c-raf AON組的c-raf mRNA水平明顯下調(diào)(P＜0.05)，而caspase-3 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P＜0.05)：c-raf AON組凋亡指數(shù)(40.5％)明顯大于對(duì)照組(30.2％)和錯(cuò)義組(29.4％)的凋亡指數(shù)(P＜0.05)。 結(jié)論：非