1、目的: 探討survivin 基因啟動子調(diào)控的siRNA 真核表達載體對HeLa 細胞中stathmin 基因表達的腫瘤特異性封閉作用。 方法: (1) 將合成的siRNA 寡核苷酸鏈退火形成雙鏈，連接入經(jīng)BamHI和HindIII 雙酶切后的pSilencer4.1-CMVneo 真核表達載體，酶切及測序鑒定。脂質體法轉染重組質粒入HeLa 細胞，G418 篩選后RT-PCR 檢測其對stathmin基因mRNA 的干

2、涉效果。 （2）PCR 擴增suvivin 基因啟動子并測序，用EcoRI和BamHI 分別雙酶切，連接至經(jīng)相同內(nèi)切酶消化的載體，獲得survivin 啟動子調(diào)控的siRNA 真核表達載體，酶切及測序鑒定。脂質體法轉染重組質粒入HeLa 細胞，G418 篩選。RT-PCR 擴增stathmin 基因，檢測其對stathmin 基因表達的干涉效果；流式細胞儀分析轉染后Hela 細胞增殖周期的改變。 結果： (1) 經(jīng)

3、酶切及測序鑒定，成功構建了CMV啟動子調(diào)控的siRNA真核表達載體。經(jīng)脂質體轉染HeLa細胞后，RT-PCR結果顯示HeLa細胞中stathmin基因的mRNA表達水平明顯降低。 （2）經(jīng)酶切及測序鑒定，成功構建了survivin基因啟動子調(diào)控的stathmin基因siRNA真核表達載體；RT-PCR結果顯示所構建的干涉載體可有效封閉stathmin基因表達；流式細胞儀分析結果顯示，Hale細胞在stathmin-siRNA作用下

4、G2/M期細胞的比例明顯增加。 結論： (1) 成功構建了人stathmin基因的RNA干涉真核表達載體pSilencer4.1-S1 和pSilencer4.1-S2，并在HeLa細胞中有效的發(fā)揮了對stathmin基因表達的干涉作用。 （2）survivin基因啟動子調(diào)控的siRNA真核表達載體可有效地封閉HeLa細胞中stathmin基因表達，并使Hela細胞阻斷于G2/M期，為以stathmin基因為靶點的