1、該研究旨在建立一種檢測不同動物HEV抗體的ELISA方法,調(diào)查不同動物對HEV的易感性,探討HEV抗體對不同重組抗原的反應(yīng)性.主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:一、動物HEV ORF2基因的克隆和表達(dá)用逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR(RT-PCR)擴增HEV新西蘭豬病毒株(Nz-s)ORF2的部分基因片段并克隆到pGEX-4T-2載體上,用雙酶切和測序的方法進行鑒定;然后用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)p166Nz-s;親和層析純化表達(dá)產(chǎn)物并

2、用PAGE電泳進行鑒定.雙酶切鑒定和測序的結(jié)果說明目的基因正確連接到載體上,電泳結(jié)果證實p166Nz-s成功表達(dá),而且所表達(dá)的重組蛋白純度高.二、用多基因型的HEV重組蛋白建立雙抗原夾心法ELISA(DS-ELISA)用p166Mix和HRP標(biāo)記的p166Mix建立DS-ELISA.用DS-ELISA檢測3只實驗感染HEV的靈長類動物系列血清.結(jié)果顯示3只實驗動物感染HEV之前和感染后短時間內(nèi)HEV抗體陰性,2~3月后陽轉(zhuǎn).說明新建立的

3、DS-ELISA方法可以用于感染不同基因型HEV的不同動物血清HEV抗體的檢測.三、與人類生活關(guān)系密切的7種動物血清HEV抗體和HEV RNA的檢測用血清學(xué)和PCR方法研究與人類生活關(guān)系密切的7種動物對HEV的易感性.結(jié)果發(fā)現(xiàn)在豬、家犬和寵物狗血清標(biāo)本中存在HEV抗體,警犬、山羊、雞、鴨、鴿子和兔血清標(biāo)本中未檢測到HEV抗體;犬血清標(biāo)本用RT-nPCR未擴增出HEV RNA.表明用多基因型HEV重組蛋白建立的雙抗原夾心法ELISA適用于

4、多種動物血清標(biāo)本HEV抗體的檢測;豬和犬對HEV易感,在HEV傳播中可能起重要作用.四、人和動物血清抗HEV抗體血清學(xué)關(guān)系的研究將代表四種基因型的HEV重組蛋白分別包被酶標(biāo)板對實驗感染HEV的靈長類動物血清以及部分HEV抗體陽性的人和動物血清標(biāo)本進行檢測,分析人和動物血清HEV抗體對不同HEV重組蛋白反應(yīng)性的差異.結(jié)果顯示,用與所感染HEV病毒株相同基因型的重組蛋白檢測效果最好;p166Pak對部分感染第Ⅳ基因型HEV病毒株的實驗動物血

5、清缺乏反應(yīng)性;大部分病人和動物血清標(biāo)本用p166Nz-s和p166Chi檢測效果較好,部分標(biāo)本對p166Pak和p166Mex反應(yīng)性較差.提示人和動物HEV抗原性存在交叉但與基因型有關(guān),人HEV第1基因型重組蛋白會對部分感染HEV第Ⅳ基因型病毒株的個體所產(chǎn)生的抗體缺乏反應(yīng)性.我們的研究結(jié)果表明,用人和動物的多基因型和亞型的HEV重組蛋白建立的檢測HEV抗體的雙抗原夾心法ELISA適用于感染不同基因型HEV病毒株的不同動物血清HEV抗體的