1、背景和目的：
　　應(yīng)用自體脂肪移植已有上百年的歷史，最初為塊狀或帶蒂移植，用于全身各個部位軟組織凹陷與缺損的填充。隨著脂肪抽吸技術(shù)的問世，使得顆粒脂肪注射移植技術(shù)成為可能，由于其來源豐富、取材容易、操作簡單、安全無排異反應(yīng)、外形自然、手感柔軟等優(yōu)點，
　　然而，顆粒脂肪移植后的高吸收活率和各種并發(fā)癥如鈣化、壞死、硬化結(jié)節(jié)和液化囊腫等限制了該顆粒脂肪注射移植技術(shù)在臨床的廣泛開展。因此，如何提高顆粒脂肪移植術(shù)后成活率，從而控制遠

2、期填充效果，成為整形外科臨床應(yīng)用及基礎(chǔ)理論研究中的重大難題之一。近十余年來眾多學者針對脂肪供區(qū)選擇、脂肪獲取方法、脂肪純化方式、脂肪注射方式等方面，從細胞因子治療、基因治療及細胞治療等多角度進行了大量研究，以提高移植脂肪的成活，盡管上述種種方法在促進移植物血管新生、預(yù)防或減輕纖維化、提高成活率方面取得了一定的效果。
　　以往研究顯示，脂肪組織有著相當豐富的血液供應(yīng)，每個脂肪細胞都有單獨的血管供應(yīng)系統(tǒng)與主干相連以保證每個脂肪細胞的營

3、養(yǎng)供應(yīng)，形成類似葡萄串樣的結(jié)構(gòu)。在顆粒脂肪注射移植過程中脂肪的獲取、收集以及注射等對脂肪細胞以及供應(yīng)血管構(gòu)成損傷，僅殘留少部分的血管片段，嚴重影響到移植物的血液供應(yīng)。此外成熟的脂肪細胞內(nèi)含有一大脂肪滴，少量細胞器被擠向邊緣，特殊的細胞結(jié)構(gòu)決定了脂肪細胞的高耗能性，成熟的脂肪細胞很容易因缺血缺氧而發(fā)生壞死，從而影響移植脂肪的成活。顆粒脂肪移植早期移植物尚未與受區(qū)建立良好的血液供應(yīng)時，缺乏有效的血液供應(yīng)而處于缺血缺氧狀態(tài)，脂肪移植物僅通過周

4、圍組織的血漿灌注獲取氧及營養(yǎng)，直至內(nèi)部血管化的形成及與毛細血管的連接建立。然而組織間液的滲透能力只有約150-200微米，在此滲透范圍以外的脂肪細胞應(yīng)該大部分發(fā)生壞死，但是對脂肪移植的長期標本觀察發(fā)現(xiàn)，脂肪移植物最終存活下來的區(qū)域并不僅限于由外周往內(nèi)部的150-200微米內(nèi)。這一結(jié)果提示在脂肪移植的后期過程中，存在著脂肪組織的新生與血運的重建。我們課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，顆粒脂肪移植后血運重建主要是由宿主來源的新生血管長入而成，移植物絕大部

5、分區(qū)域的細胞為宿主來源，因此宿主也就是受區(qū)的血管化條件、細胞再生條件在移植物成活過程中發(fā)揮著重要作用。
　　目前對不同受區(qū)脂肪移植成活率的研究尚存有爭議，1996年Guerrerosantos首先在大鼠肌肉內(nèi)進行脂肪移植獲得成功。Karacaoglu進行了兔皮下、肌肉上、肌肉下脂肪移植的比較，發(fā)現(xiàn)6個月后咬肌上保存率約82％，其認為可以通過選擇受區(qū)來提高脂肪移植的存活。但Rieck則發(fā)現(xiàn)移植脂肪的成活率為皮下30％，肌肉內(nèi)6％，肌

6、肉內(nèi)注射并不增加成活，原因可能是肌肉間空隙小、張力大，雖然肌肉中血供豐富，但活動時肌肉收縮擠壓移植脂肪，反而影響血供。臨床方面，Yoshimura等認為，胸大肌前后間隙血管豐富且利于乳房塑形，故此兩層次均適合注射脂肪，面部脂肪移植最佳的注射層次可能包括皮下脂肪和肌肉層。Coleman等認為，不僅在胸大肌前后間隙，在胸大肌內(nèi)亦適合注射脂肪。李青峰認為脂肪組織間的脂肪顆粒移植較其他部位有更高的存活率，受區(qū)組織生理同源性環(huán)境有利于移植脂肪的成

7、活。究竟皮下、脂肪內(nèi)和肌肉內(nèi)何為顆粒脂肪移植的最佳受區(qū)，目前尚無定量的實驗證實;對于不同移植部位所導(dǎo)致的成活率差異仍缺乏進一步的研究。
　　基于以上科學問題，本實驗將帶有綠色熒光小鼠的顆粒脂肪分別注射移植到普通C57小鼠的背部皮下、股二頭肌肌肉內(nèi)及腹股溝脂肪墊內(nèi)，觀察不同組織層次移植脂肪的生存狀況，從而選擇最佳的脂肪移植受區(qū)。明確這個問題對提高脂肪移植成活率有著重要的意義。
　　方法：
　　采用兩種近交系小鼠，將由GF

8、P小鼠獲取的雙側(cè)腹股溝脂肪剪碎，通過16-gauge針頭將其分別注射移植到C57小鼠的雙側(cè)背部皮下、股二頭肌肌肉內(nèi)及腹股溝脂肪墊內(nèi)，每個注射點注射量為0.1ml。實驗分為三組（每組35只）:皮下組(subcutaneous);肌肉內(nèi)組（intramusculary）;脂肪內(nèi)組(fat pad)。
　　1、濕重測量
　　取0.1ml GFP鼠腹股溝粉碎脂肪稱重，做為之后脂肪移植物濕重基線，注射后每組分別于1、4、8、12、16

9、周(W)處死小鼠各7只取材，并再測濕重(n=7)。得出移植物的濕重保存率。
　　2、組織學觀察，毛細血管密度測量和結(jié)締組織定量
　　將三組獲取的脂肪組織HE染色，切片顯微鏡觀察、數(shù)碼相機拍照。40倍鏡下觀察每個HE切片20個視野中毛細血管數(shù)，評估新生血管形成。
　　3、GFP表達和CD34、Ki67免疫組化染色
　　熒光顯微鏡觀察冰凍切片綠色熒光表達。每個移植物100倍鏡下合成完整圖像，使用ImageJ軟件測定G

10、FP陽性所占總面積的百分比，了解移植物中移植物來源組織所占比例。選取顆粒脂肪移植后4W的組織，進行CD34、Ki67免疫組化染色以比較組織內(nèi)CD34陽性前體細胞數(shù)量，從而探討組織再生能力。
　　結(jié)果：
　　1、大體觀察:1W時3組移植物表面均可見包膜形成，大體觀察無明顯差異。8W時脂肪內(nèi)組體積稍大于其他兩組，16W時脂肪內(nèi)組移植物體積明顯大于其他兩組移植物，且外觀上更接近正常脂肪。移植物的濕重保存率:三組移植物保存率均在移植

11、后出現(xiàn)了明顯的下降，1-8W下降最為明顯，8-16W保存率趨于平穩(wěn)。脂肪內(nèi)組保存率第8周起即明顯高于皮下組及肌肉內(nèi)組(P＜0.05)，16W皮下組保存率明顯高于肌肉內(nèi)組(P＜0.05)。
　　2、組織學觀察:皮下組內(nèi)脂肪壞死區(qū)域較多，肌肉內(nèi)組最小。4W脂肪內(nèi)組及肌肉內(nèi)組移植物表現(xiàn)出更好的血管化和小體積脂肪細胞，至16W脂肪內(nèi)組及肌肉內(nèi)組移植物組織結(jié)構(gòu)十分接近正常脂肪組織，但肌肉內(nèi)組中成熟脂肪細胞的直徑明顯小于其他兩組。半定量測量:

12、三組移植物的血管密度及血管化結(jié)締組織面積變化類似，移植后4周達到高峰，4W后較為緩和下降。肌肉內(nèi)組中的血管密度在移植后4周起即明顯高于其他兩組。結(jié)果提示肌肉內(nèi)移植物血管化最好，而長期觀察脂肪墊內(nèi)移植物成脂效果最好。
　　3、三組移植物GFP陽性的區(qū)域隨時間逐漸減少，且集中于移植物外圍，半定量熒光面積在移植后1-8W下降明顯，8-16W緩和下降。肌肉內(nèi)組中的熒光面積比率從第4周開始即一直高于其余兩組(P＜0.05)。皮下組及脂肪內(nèi)組

13、在各個時間點均無統(tǒng)計學差異。結(jié)果提示三組移植物外圍均可見來源于移植物的脂肪細胞存活，肌肉內(nèi)移植物來源脂肪細胞存活率最高。4WCD34、Ki67免疫組化染色，脂肪墊移植物內(nèi)有增殖活性的（Ki67表達陽性）CD34陽性細胞數(shù)量較多。
　　討論：
　　Yoshimura等近期的研究指出，脂肪移植后的保存并非簡單的存活或替代，而是一種混合的保存方式:存活區(qū)（最外層）、壞死區(qū)（中央層）、再生區(qū)（外層和中央層之間），即移植物外層存活，內(nèi)

14、層被ASCs參與的組織再生所取代，中央壞死區(qū)域被吸收或形成油囊，油囊的存在一定時間內(nèi)起到支架作用，使移植物保留一定的體積。因此，影響移植物遠期保存的兩個根本因素為源自移植物組織的存活以及組織再生狀況。
　　然而有趣的是，濕重測量顯示脂肪墊內(nèi)最終成活率最高,而在血管環(huán)境最好的肌肉內(nèi)最終成活率最低。其原因何在?我們認為可能有兩個原因，第一，Yoshimura等研究提示正常脂肪細胞耐受缺血缺氧能力很差，僅有移植物外圍小于300μm的范圍

15、內(nèi)的脂肪細胞通過吸收滲透組織液的營養(yǎng)來度過缺血缺氧期，超過此有效距離的脂肪細胞大都壞死，接著在耐受缺血缺氧能力強的脂肪干細胞/間質(zhì)細胞/祖細胞啟動下新生的脂肪細胞替換死亡的脂肪細胞，脂肪移植后期成熟的脂肪細胞主要來源于干細胞啟動的再生。遠期脂肪移植成活率是由之后的脂肪再生決定的，肌肉內(nèi)脂肪移植物中雖然有一定的移植物來源組織存活，但在移植物長期體積保存中所占比例較少，對遠期體積保存的最終結(jié)果影響較少。第二，組織來源或宿主來源干細胞/祖細胞

16、（如ASCs）在脂肪移植后脂肪再生中發(fā)揮著重要作用。有研究表明微環(huán)境決定了ASCs的命運和活性，脂肪墊內(nèi)含有大量ASCs以及各種細胞所分泌的了促進成脂的因子，能為移植物提供一個適當?shù)某芍h(huán)境，這是脂肪移植后脂肪再生的關(guān)鍵。
　　機械力引起的肌肉運動有可能抑制ASCs的成脂分化。有研究指出，游離脂肪加上肉毒素A聯(lián)合注射，可以顯著降低脂肪移植重吸收水平。脂肪組織的各種細胞，特別是ASCs，是有力學敏感性的。有研究發(fā)現(xiàn)靜態(tài)拉伸或低應(yīng)力

17、可以促進脂肪生成。然而動態(tài)機械力例如:循環(huán)拉伸或振動和靜態(tài)壓縮抑制脂肪生成。不僅機械力可以影響分化，而且基質(zhì)硬度直接針對性影響間充質(zhì)干細胞的分化。這或許可以解釋16W時為什么肌肉內(nèi)脂肪移植成熟脂肪細胞直徑與其它兩組相比顯著偏小，肌肉內(nèi)脂肪移植成活率低可能部分與肌肉運動有關(guān)。同樣的我們發(fā)現(xiàn)脂肪墊內(nèi)與皮下層脂肪移植后移植物毛細血管密度沒有明顯差異，但脂肪墊內(nèi)脂肪移植物比皮下層有更好的成活率。不同受區(qū)脂肪移植成活率的差異有可能是不同的生物、化