1、研究背景和研究目的:
　　 人原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率約2～5/10萬;并且這些腫瘤中，85％為顱內(nèi)腫瘤，15％為椎管內(nèi)腫瘤。顱內(nèi)腫瘤以膠質(zhì)瘤最為多見（約占40％），其次為腦膜瘤(13％～19％)，聽神經(jīng)瘤（神經(jīng)鞘瘤）(8％～9％)。膠質(zhì)瘤中，惡性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤（膠質(zhì)母細(xì)胞瘤）占50％～60％，良性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤約占25％～30％。兒童的顱內(nèi)腫瘤發(fā)病率甚高，僅次于白血病而占小兒惡性腫瘤的第2位;兒童顱內(nèi)腫瘤除膠質(zhì)瘤外，髓母細(xì)

2、胞瘤最常見。
　　 神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的主要癥狀:
　　 ①腫瘤壓迫或破壞周圍腦組織所引起的局部神經(jīng)癥狀，如癲癇、癱瘓、視野缺損等。
　　 ②顱內(nèi)占位病變引起顱內(nèi)壓增高的癥狀，表現(xiàn)為頭痛、嘔吐、視神經(jīng)乳頭水腫等。
　　 nestin是一種中間絲類型的蛋白，能夠特異性的表達(dá)在神經(jīng)上皮干細(xì)胞上，為神經(jīng)干細(xì)胞的特征性標(biāo)志物之一。
　　 nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠是一種最常用的研究神經(jīng)干細(xì)胞的一種工具鼠

3、，該GFP基因插入在nestin啟動(dòng)子下游，受nestin基因的調(diào)控，應(yīng)用nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠可以標(biāo)記和示蹤神經(jīng)干細(xì)胞的分化和遷移。
　　 目前對于神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的研究已經(jīng)有了很大的進(jìn)展，但是對于神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的早期細(xì)胞起源和分子發(fā)生機(jī)制并不明確。大部分神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤在早期由于不能被及時(shí)發(fā)現(xiàn)，很難獲得腫瘤早期的標(biāo)本。當(dāng)患者出現(xiàn)較明顯的臨床癥狀時(shí)，疾病大都已經(jīng)發(fā)展到中晚期階段，此時(shí)的細(xì)胞類型和分子標(biāo)記已經(jīng)發(fā)生了較大的變化，

4、因此其相應(yīng)研究只是一種回顧性研究，并不能如實(shí)反映神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的早期變化。Nestin陽性報(bào)告小鼠神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤模型的建立將為研究神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的早期細(xì)胞起源和分子發(fā)生機(jī)制提供重要的工具，其可能的應(yīng)用如下:
　　 (1)揭示神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的早期細(xì)胞起源及分子發(fā)生機(jī)制;
　　 (2)利用腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞位置的相對局限性和與神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤存在的異位性來研究神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤干細(xì)胞的來源，闡明神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤發(fā)生的可能機(jī)制;
　　 (3)研

5、究神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤干細(xì)胞的來源和神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的轉(zhuǎn)化靶點(diǎn)不僅對神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病機(jī)制具有重要意義，而且對神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的治療策略亦具有指導(dǎo)意義，即室管膜下層殘存的腫瘤干細(xì)胞是新的治療靶點(diǎn);
　　 (4)研究室管膜下層腫瘤干細(xì)胞遠(yuǎn)處遷移能力，探索神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制。
　　 我們的研究包含以下幾個(gè)部分:首先我們對nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠的特征進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察;在此基礎(chǔ)上，我們應(yīng)用ENU化學(xué)誘導(dǎo)nestin-GFP轉(zhuǎn)基因

6、報(bào)告小鼠，試圖建立nestin陽性報(bào)告小鼠神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤模型，并對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察;最后，我們探討其他方式建立nestin陽性報(bào)告小鼠神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤模型的建立方法及初步的研究。
　　 方法:
　　 1.nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠的形態(tài)學(xué)觀察
　　 (1)應(yīng)用整體熒光成像觀察nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠在胚胎時(shí)期和出生后nestin的表達(dá)及動(dòng)態(tài)變化;
　　 (2)應(yīng)用免疫組化和免疫熒光觀察成年n

7、estin-GFP轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠腦的nestin的定位和表達(dá)。
　　 2.ENU化學(xué)誘導(dǎo)nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠后形態(tài)學(xué)觀察
　　 (1)胎盤誘導(dǎo)
　　 取妊娠末期nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠19只，按8個(gè)劑量:50mg/kg、83mg/kg、167mg/kg、200mg/kg、233mg/kg、250mg/kg、267mg/kg、300mg/kg經(jīng)腹腔內(nèi)一次性注射1％ ENU溶液，子代小鼠出生三

8、周后與母鼠分開，雌雄分籠單獨(dú)喂養(yǎng)。仔細(xì)觀察子代小鼠的臨床癥狀，包括睡眠、食欲、步態(tài)、體溫、精神、體重、毛發(fā)的色澤等。
　　 (2)直接誘導(dǎo)
　　 取成年nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠13只，按200mg/kg一次性腹腔注射1％ENU溶液，雌雄分籠單獨(dú)喂養(yǎng)。仔細(xì)觀察誘導(dǎo)小鼠的臨床癥狀，包括睡眠、食欲、步態(tài)、體溫、精神、體重、毛發(fā)的色澤等。
　　 解剖出現(xiàn)癥狀和頻臨死亡的二種方法誘導(dǎo)得到的小鼠，所有標(biāo)本經(jīng)固定、脫

9、水、石蠟包埋后切片，行HE染色，光鏡下判斷腫瘤生長情況。
　　 3.nestin陽性小鼠髓母細(xì)胞瘤模型的建立及初步研究
　　 (1)nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠和Ptch雜合子小鼠(Ptch-/+)雜交，獲得nestin陽性Ptch雜合子小鼠（nestin-GFP-/+/Ptch-/+）;
　　 (2)提取子代小鼠的DNA后，行PCR，然后瓊脂糖凝膠電泳，對小鼠基因進(jìn)行鑒定;
　　 (3) nest

10、in陽性Ptch雜合子小鼠成瘤后，對成瘤小鼠的腦進(jìn)行肉眼大體和整體熒光成像的觀察;
　　 (4) nestin陽性Ptch雜合子小鼠（nestin-GFP-/+/Ptch-/+）成瘤后，對成瘤小鼠的腦組織進(jìn)行組織病理學(xué)觀察;
　　 (5) nestin陽性報(bào)告小鼠髓母細(xì)胞瘤模型發(fā)生、發(fā)展不同階段的腦組織的組織學(xué)動(dòng)態(tài)觀察。
　　 結(jié)果:
　　 1.在整體熒光成像下觀察nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠，發(fā)現(xiàn)

11、:
　　 (1)大腦、小腦及嗅球在三周前 nestin均有表達(dá)，并且各個(gè)部分之間表達(dá)強(qiáng)度沒有明顯差異;在三周后大腦和小腦表達(dá)均明顯減弱;而嗅球在不同的發(fā)育階段nestin均明顯表達(dá)，與不同的發(fā)育階段無關(guān)。
　　 (2)小鼠胰腺中nestin的表達(dá)較強(qiáng)且較恒定，與不同的發(fā)育階段無關(guān)。
　　 2.免疫組化和免疫熒光結(jié)果表明，大部分nestin陽性細(xì)胞位于腦室周圍室管膜細(xì)胞的胞漿，并且呈強(qiáng)陽性表達(dá);部分nestin陽性

12、細(xì)胞在大腦皮質(zhì)、大腦髓質(zhì)、海馬及小腦有散在表達(dá)。
　　 3.取妊娠末期nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠19只，按8個(gè)劑量經(jīng)腹腔內(nèi)一次性注射1％ ENU溶液，共產(chǎn)出110只子代小鼠，具體病變?nèi)缦?
　　 (1)肺腺瘤22例，平均成瘤時(shí)間約為11個(gè)月;肺腺癌24例，平均成瘤時(shí)間約為11個(gè)月;淋巴瘤5例（伯基特樣淋巴瘤2例，彌漫大B細(xì)胞樣淋巴瘤3例），平均成瘤時(shí)間約為7個(gè)月;卵巢腫瘤1例，成瘤時(shí)間約為14個(gè)月;大腦海綿狀血管

13、瘤1例，成瘤時(shí)間約為8個(gè)月。
　　 (2)按50mg/kg胎盤誘導(dǎo)9只子代小鼠，有2只子代小鼠成瘤，成瘤率為22.2％;83mg/kg劑量胎盤誘導(dǎo)時(shí)生出子代小鼠26只，有6只子代小鼠成瘤，成瘤率為23.1％;167mg/kg胎盤誘導(dǎo)17只，有6只小鼠成瘤，成瘤率為35.3％;200mg/kg胎盤誘導(dǎo)18只，有7只小鼠成瘤，成瘤率為38.9％;233mg/kg胎盤誘導(dǎo)17只，有12只小鼠成瘤，成瘤率為70.6％;250mg/kg胎

14、盤誘導(dǎo)7只，有6只小鼠成瘤，成瘤率為85.7％;267mg/kg胎盤誘導(dǎo)8只，有7只小鼠成瘤，成瘤率為87.5％;300mg/kg胎盤誘導(dǎo)8只，有7只小鼠成瘤，成瘤率為87.5％。劑量和成瘤率的差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，劑量越高成瘤率越高(x2=25.300，P＜0.001)。
　　 4.使用200mg/kg劑量的ENU直接誘導(dǎo)成年nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠13只，有6只小鼠成瘤，均為胸腺淋巴瘤，平均成瘤時(shí)間約為6個(gè)月，成

15、瘤率為46.2％。
　　 5.ENU經(jīng)胎盤誘導(dǎo)nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠110只，有53只小鼠成瘤，成瘤率為48.2％;使用200mg/kg劑量的ENU直接誘導(dǎo)成年nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠13只，成瘤的小鼠有6只，成瘤率為46.2％。直接誘導(dǎo)和經(jīng)胎盤誘導(dǎo)成瘤率的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.019，P=0.890)。
　　 6.通過Ptch雜合子小鼠與nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠雜交獲得nest

16、in陽性Ptch雜合子小鼠(nestin-GFP-/+/Ptch-/+)，大約10個(gè)月之后，小鼠出現(xiàn)髓母細(xì)胞瘤樣改變，瘤組織nestin呈強(qiáng)陽性表達(dá)，組織病理學(xué)證實(shí)nestin陽性Ptch雜合子小鼠可發(fā)展成髓母細(xì)胞瘤，在髓母細(xì)胞瘤形成的早期我們觀察到nestin陽性Ptch雜合子小鼠的小腦外顆粒層細(xì)胞明顯增生。
　　 7.nestin陽性報(bào)告小鼠的髓母細(xì)胞瘤模型不同階段形態(tài)學(xué)動(dòng)態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)髓母細(xì)胞瘤形成的初期小鼠模型側(cè)腦室的一側(cè)

17、細(xì)胞明顯增生并且側(cè)腦室處增生的細(xì)胞有較強(qiáng)的nestin表達(dá)，在髓母細(xì)胞瘤形成的中期小鼠模型的小腦外顆粒層細(xì)胞明顯增生并且增生的外顆粒層細(xì)胞有較強(qiáng)的nestin表達(dá)，在成瘤后觀察到腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的nestin表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1.nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠腦內(nèi)nestin陽性的細(xì)胞的大部分位于腦室室管膜下層(SVZ)，少部分散在分布于腦的其他部位，與神經(jīng)干細(xì)胞的定位和分布一致，所以nestin-GFP轉(zhuǎn)基

18、因報(bào)告小鼠可以很好地應(yīng)用于神經(jīng)干細(xì)胞的示蹤和分析。
　　 2.ENU化學(xué)誘導(dǎo)nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠可誘導(dǎo)小鼠肺腺瘤、肺腺癌、淋巴瘤、腦海綿狀血管瘤、卵巢腫瘤，但是不能誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。
　　 3.應(yīng)用Ptch雜合子小鼠與nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠雜交獲得nestin陽性Ptch雜合子小鼠，可成功建立nestin陽性報(bào)告小鼠的髓母細(xì)胞瘤模型，為髓母細(xì)胞瘤的早期細(xì)胞起源及分子發(fā)生機(jī)制的研究提供了重要的工具