1、研究背景：
　　急性脊髓損傷(Spinalcordinjury，SCI)是臨床中常見的一類運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，可致不同程度的肢體四癱或截癱以及勞動(dòng)能力的喪失，給社會(huì)和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。研究表明，細(xì)胞凋亡是急性SCI后脊髓繼發(fā)性損傷加劇的重要原因，減少細(xì)胞凋亡對(duì)于促進(jìn)脊髓創(chuàng)傷后修復(fù)具有重要意義。
　　MicroRNA(miRNA)是生物體內(nèi)一類較短（約19～22個(gè)核苷酸）的非編碼單鏈小分子RNA，通過與其靶mRNA的3'UTR區(qū)以完

2、全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)配對(duì)的方式相結(jié)合，誘導(dǎo)其降解或抑制其翻譯的作用，從而發(fā)揮其調(diào)控基因表達(dá)的功能。近年來，有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-21與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷有關(guān)。其中miR-21在許多細(xì)胞和動(dòng)物模型中被證實(shí)具有強(qiáng)大的抗凋亡作用，但其在急性SCI中的作用尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。
　　川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP）是一種從中藥川芎中提取的生物活性單體。近年來，本課題組研究表明TMP對(duì)急性SCI具有抗凋亡作用。但其抗凋亡機(jī)制尚有待進(jìn)

3、一步研究。為此，本研究以大鼠急性SCI模型為基礎(chǔ)，探討miR-21在急性SCI中是否具有抗凋亡作用及TMP在急性SCI的抗凋亡作用是否與調(diào)控miR-21及其凋亡相關(guān)靶基因的表達(dá)有關(guān)。為治療急性SCI提供新的治療靶點(diǎn)。
　　第一章MicroRNA在大鼠急性脊髓損傷中的表達(dá)譜及其生物學(xué)分析
　　目的：
　　探討miRNA在大鼠SCI后的表達(dá)譜變化，分析其可能參與SCI繼發(fā)性損傷的機(jī)制。
　　方法：
　　(1)實(shí)

4、驗(yàn)動(dòng)物分組:成年雄性SD大鼠(180-220g)12只，隨機(jī)分成4組(n=3):SCI-1d組;SCI-3d組;Sham-1d組;Sham-3d組。SCI-1d和SCI-3d組大鼠采用自制Allen's打擊法制作急性脊髓損傷模型;Sham-1d和sham-3d組僅行椎板切除術(shù)。
　　(2)總RNA的提取:采用Trizol法提取脊髓組織總RNA。
　　(3)微陣列芯片實(shí)驗(yàn):利用miRCURYTMLNAArray(v.16.0)

5、芯片檢測(cè)4組中miRNA的表達(dá)譜。
　　(4)芯片驗(yàn)證:運(yùn)用qRT-PCR驗(yàn)證4個(gè)差異表達(dá)的miRNAs(miR-21、miR-126、miR-24和let-7b)。
　　(5)生物信息學(xué)分析:運(yùn)用Mirbase、Miranda和Mirdb三個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件分析異常表達(dá)的miRNAs所調(diào)控的靶基因及運(yùn)用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析靶基因所涉及的信號(hào)通路。
　　結(jié)果：
　　(1)microRNA芯片結(jié)果:共有22個(gè)miRNA

6、s出現(xiàn)異常表達(dá)。其中1d組14個(gè):9個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)，5個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào);3d組8個(gè):3個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)，5個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)。
　　(2)芯片驗(yàn)證:qRT-PCR結(jié)果示:miR-21在SCI后1天表達(dá)無(wú)顯著變化，3天表達(dá)上調(diào)(P＜0.01);miR-126在SCI后1天表達(dá)無(wú)顯著變化，3天表達(dá)下調(diào)(P＜0.05);miR-24在SCI后1天表達(dá)無(wú)顯著變化，3天表達(dá)下調(diào)(P＜0.01);let-7b在SCI后

7、1天表達(dá)下調(diào)，3天表達(dá)無(wú)顯著變化(P＜0.05)。
　　(3)生物信息學(xué)分析:miR-21靶基因有22個(gè)，miR-24靶基因19個(gè)，miR-126靶基因17個(gè)，let-7b靶基因7個(gè)。pathway分析:這4個(gè)驗(yàn)證的miRNAs所調(diào)控的靶基因與以下通路有關(guān):Valine，leucineandisoleucinedegradation、Butanoatemetabolism、Endocytosis、Propanoatemetabol

8、ism、Fattyacidmetabolism、Tryptophanmetabolism、Lysinedegradation、Wntsignalingpathway、NOD-likereceptorsignalingpathway和Chemokinesignalingpathway。
　　結(jié)論：
　　(1)大鼠急性脊髓損傷后miRNA的表達(dá)譜發(fā)生變化;
　　(2)異常表達(dá)的miRNA所調(diào)控的靶基因與急性脊髓損傷的病理機(jī)

9、制密切相關(guān)。
　　第二章MicroRNA-21在大鼠急性脊髓損傷中的抗凋亡作用
　　目的：
　　miR-21在許多細(xì)胞及動(dòng)物模型中被證實(shí)具有抗凋亡作用，本實(shí)驗(yàn)探討其在大鼠急性脊髓損傷中是否具有抗凋亡作用。
　　方法：
　　成年雄性SD大鼠(108-220g)56只，以改良Allen's打擊法制作急性脊髓損傷(SCI)模型，隨機(jī)分為Antagomir-21治療組(n=28)和Negativecontrol治療

10、組(n=28)。Antagomir-21組大鼠于術(shù)后至術(shù)后3天予以Antagomir-21治療，通過膠囊滲透壓泵予以鞘內(nèi)給藥（200nmol/ml，1μl/h）（1天組給藥至處死前）;Negativecontrol組大鼠予以等量Antagomir-21Negativecontrol作相同干預(yù)，給藥時(shí)間、劑量和速度同Antagomir-21組。每組(n=8)SCI大鼠分別用于檢測(cè)FasL、PDCD4和PTEN的表達(dá)水平（WesternBl

11、ot，n=4每個(gè)時(shí)間點(diǎn)）;每組(n=8)SCI大鼠分別用于檢測(cè)miR-21的表達(dá)量(qRT-PCR，n=4每個(gè)時(shí)間點(diǎn));每組(n=8)SCI大鼠分別用于組織化學(xué)方面的檢測(cè)，如免疫組化、TUNEL和原位雜交;每組(n=4)SCI大鼠分別用于行為學(xué)評(píng)分(BBB評(píng)分)和損傷體積的評(píng)估，損傷后行為學(xué)評(píng)估至28天，隨后處死用于損傷體積的評(píng)估。應(yīng)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用T檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：<

12、br>　　(1)行為學(xué)評(píng)分:在SCI后，在兩組中均可見大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能逐漸恢復(fù)。與Antagomir-21組大鼠比較，Negativecontrol組大鼠恢復(fù)較快，在SCI14天后BBB評(píng)分顯著增高(14天，P＜0.05;21和28天，P＜0.01)。
　　(2)組織學(xué)評(píng)價(jià):在SCI28天后，兩組脊髓組織中均可見有空洞形成。Antagomir-21組的空洞體積較Negativecontrol組大，殘存正常脊髓組織較后者少。

13、　　(3)Antagomir-21抑制效果評(píng)價(jià):在SCI1和3天，Antagomir-21組大鼠脊髓組織中miR-21的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較Negativecontrol組顯著減少(P＜0.05);qRT-PCR結(jié)果示:Antagomir-21組大鼠脊髓組織中miR-21的表達(dá)量較Negativecontrol組顯著減少(P＜0.01)。
　　(4)Antagomir-21對(duì)細(xì)胞凋亡的影響:在SCI1天，Antagomir-21組大鼠脊髓

14、組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與Negativecontrol組無(wú)顯著變化;在SCI3天，Antagomir-21組大鼠脊髓組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較Negativecontrol組顯著減少(P＜0.05)。
　　(5)Antagomir-21對(duì)FasL、PTEN與PDCD4表達(dá)的影響:
　　1)FasL:Westernblot結(jié)果示SCI1天，F(xiàn)asL蛋白兩組表達(dá)無(wú)差異;SCI3天，Antagomir-21組中FasL蛋白的

15、表達(dá)量較Negativecontrol組顯著增高(P＜0.05)。
　　2)免疫組化結(jié)果示PTEN主要在大鼠脊髓組織中的神經(jīng)元細(xì)胞胞漿中表達(dá)，亦可見部分神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿中表達(dá)。SCI1天，兩組中PTEN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)差異;SCI3天，Antagomir-21組中PTEN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較Negativecontrol組顯著增多(P＜0.05)。Westernblot結(jié)果示SCI1天，PTEN蛋白兩組表達(dá)無(wú)差異;SCI3天，Antagom

16、ir-21組中PTEN蛋白的表達(dá)量較Negativecontrol組顯著增高(P＜0.05)。
　　3)PDCD4主要在大鼠脊髓組織中的神經(jīng)元細(xì)胞胞漿中表達(dá)，亦可見部分神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿中表達(dá)。SCI1和3天，兩組中PTEN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)差異。Westernblot結(jié)果示SCI1和3天，PDCD4蛋白在兩組中表達(dá)無(wú)差異。
　　結(jié)論：
　　(1)miR-21在大鼠急性脊髓損傷中起抗凋亡的作用;
　　(2)miR-21

17、在大鼠急性脊髓損傷中起抗凋亡的機(jī)制，可能是通過調(diào)控促凋亡靶基因FasL和PTEN的表達(dá)其作用。
　　第三章川芎嗪在大鼠急性脊髓損傷中對(duì)microRNA-21的調(diào)控作用
　　目的：
　　在前期的研究中，已證明TMP在大鼠SCI中具有抗凋亡作用，但其抗凋亡機(jī)制仍不明確。本實(shí)驗(yàn)探討TMP在大鼠SCI中能否通過調(diào)控miR-21及其凋亡靶基因的表達(dá)，影響凋亡細(xì)胞的表達(dá)。
　　方法：
　　成年雄性SD大鼠(108-22

18、0g)52只，以改良Allen's打擊法制作急性脊髓損傷(SCI)模型，隨機(jī)分為TMP治療組(n=28)和Control治療組(n=28)。TMP組大鼠于術(shù)后30min至術(shù)后3天予以TMP治療，通過腹腔注射給藥（200mg/kg，1次/天）（1天組給藥至處死前）;Control組大鼠予以等量生理鹽水作相同干預(yù)，給藥時(shí)間、劑量和速度同TMP組。每組(n=6)SCI大鼠分別用于檢測(cè)FasL、PDCD4和PTEN的表達(dá)水平(WesternBl

19、ot，n=3每個(gè)時(shí)間點(diǎn));每組(n=8)SCI大鼠分別用于檢測(cè)miR-21的表達(dá)量（qRT-PCR，n=4每個(gè)時(shí)間點(diǎn)）;每組(n=8)SCI大鼠分別用于組織化學(xué)方面的檢測(cè)，如免疫組化、TUNEL和原位雜交;每組(n=4)SCI大鼠分別用于行為學(xué)評(píng)分(BBB評(píng)分)和損傷體積的評(píng)估，損傷后行為學(xué)評(píng)估至28天，遂后處死用于損傷體積的評(píng)估。應(yīng)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用T檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：<

20、br>　　(1)行為學(xué)評(píng)分:在SCI后，在兩組中均可見大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能逐漸恢復(fù)。與Control組大鼠比較，TMP組大鼠恢復(fù)較快，在SCI7天后BBB評(píng)分顯著增高(7和14天，P＜0.05;21和28天，P＜0.01)。
　　(2)組織學(xué)評(píng)價(jià):在SCI28天后，兩組脊髓組織中均可見有空洞形成。TMP組的空洞體積較Saline組小，殘存正常脊髓組織較后者多。
　　(3)TMP對(duì)miR-21表達(dá)的影響:在SCI1和3天，TMP組

21、大鼠脊髓組織中miR-21的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較Control組顯著增多(1天，P＜0.05;3天，P＜0.01);qRT-PCR結(jié)果示:TMP組大鼠脊髓組織中miR-21的表達(dá)量較Control組顯著減少(1天，P＜0.05;3天，P＜0.01)。
　　(4)TMP對(duì)細(xì)胞凋亡的影響:在SCI1和3天，TMP組大鼠脊髓組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較Control組顯著增多(1天，P＜0.05;3天，P＜0.01)。
　　(5)TMP對(duì)

22、凋亡基因FasL、PTEN與PDCD4表達(dá)的影響:
　　1)FasL:Westernblot結(jié)果示SCI1天，F(xiàn)asL蛋白兩組表達(dá)無(wú)差異;SCI3天，TMP組中FasL蛋白的表達(dá)量較Control組顯著降低(P＜0.01)。
　　2)免疫組化結(jié)果示PTEN主要在大鼠脊髓組織中的神經(jīng)元細(xì)胞胞漿中表達(dá)，亦可見部分神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞胞漿中表達(dá)。SCI1天，兩組中PTEN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)差異;SCI3天，TMP組中PTEN陽(yáng)性細(xì)

23、胞數(shù)較Control組顯著減少(P＜0.01)。Westernblot結(jié)果示SCI1天，PTEN蛋白兩組表達(dá)無(wú)差異;SCI3天，TMP組中PTEN蛋白的表達(dá)量較Control組顯著降低(P＜0.05)。
　　3)PDCD4主要在大鼠脊髓組織中的神經(jīng)元細(xì)胞胞漿中表達(dá)，亦可見部分神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞胞漿中表達(dá)。SCI1天，兩組中PTEN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)差異;SCI3天，TMP組中PDCD4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較Control組顯著減少(P＜0