1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各類疾患：炎癥、腫瘤、血管病變和外傷等的病理發(fā)生、進展都會涉及到缺氧這個環(huán)節(jié)。充分了解缺氧后神經(jīng)系統(tǒng)解剖、生理變化，對臨床認識這些疾病會有很大幫助。大多數(shù)神經(jīng)科學研究者把目光投向了神經(jīng)元一中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的特質(zhì)細胞。其實缺氧在引起神經(jīng)元的損傷前，血腦屏障的開放或功能異常已經(jīng)發(fā)生，但缺氧如何引起血腦屏障的各種生理病理變化的?其分子機制如何?這是我們研究的焦點。所以，本文通過體外建立血腦屏障模型，初步探索了缺氧對血腦屏障組成的重

2、要部分一腦微血管內(nèi)皮細胞和星形膠質(zhì)細胞的影響，以及缺氧對血腦屏障屏障功能的作用，探討了其中可能的分子生物學與病理生理機制。 方法：1．采用腦微血管內(nèi)皮細胞和星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)的三維細胞培養(yǎng)技術建立體外血腦屏障模型。2．HE染色觀察細胞在多聚酯膜上的生長情況。檢測共培養(yǎng)以后血腦屏障特異性酶γ．GT含量；測定經(jīng)腦微血管內(nèi)皮細胞間隙進入血腦屏障的熒光素鈉(FLU，分子量376Da)的通透量，通透性用通透系數(shù)表示，記錄不同時間點125I

3、-BSA(分子量66kDa)在血腦屏障模型上的的通透量，以評價血腦屏障模型的功能狀態(tài)。3．模擬在體缺氧狀態(tài)，監(jiān)測缺氧后不同時間點，腦微血管內(nèi)皮細胞生長的外環(huán)境中氧分壓(Pa02)、二氧化碳分壓(PaC02)、PH值、滲透壓、葡萄糖含量的變化，以及乳酸脫氫酶(LDH)的含量：用流式細胞儀檢測細胞體積的變化。采用激光共聚焦顯微鏡檢測細胞漿內(nèi)游離鈣離子的變化。4．通過檢測熒光示蹤劑熒光素鈉(FLU)通過血腦屏障量的變化，評價缺氧對血腦屏障的屏

4、障功能的影響。5．采用半定量RT-PCR、Western-Blot的方法探索缺氧對血腦屏障緊密連接蛋白ZO．1、Occludin表達的影響。6．采用半定量RT-PCR、Western-Blot的方法探索缺氧對星形膠質(zhì)細胞AQP4表達的影響。 結(jié)果：1．采用分離培養(yǎng)方法獲得的腦微血管內(nèi)皮細胞在倒置顯微鏡下細胞呈多角形或“鋪路石”形，單層貼壁生長。培養(yǎng)的細胞Ⅷ因子相關抗原免疫染色陽性，細胞純度為90％。采用振蕩培養(yǎng)法獲得的l型星形膠

5、質(zhì)細胞GFAP免疫細胞染色呈陽性，陽性細胞純度達到98％。2．共培養(yǎng)后的內(nèi)皮細胞表現(xiàn)出典型細胞形態(tài)，血腦屏障特異性酶Y—GT含量原代細胞為l6．42U／mgcellprotein，傳至第2代為3．69U／mgcellprotein，與1型星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)的第2代腦微血管內(nèi)皮細胞，Y．GT含量則為11．3U／rogcellprotein、隨著共培養(yǎng)，酶活性增強；共培養(yǎng)模型對細胞間轉(zhuǎn)運的低分子量物質(zhì)熒光素鈉的通透系數(shù)為9．0±1．022×

6、10-6cm／s，對經(jīng)受體轉(zhuǎn)運的牛血清白蛋白(BSA)在實驗進行的1～2小時內(nèi)的通透表現(xiàn)出一定的飽和性。3．缺氧后，細胞生長環(huán)境中主要表現(xiàn)為Pa02、PH值降低，而PaC02、滲透壓和葡萄糖含量和對照組比較則變化不明顯(P值分別為0．436、0．163、O．132)。對照組與缺氧組Pa02在整個實驗時間內(nèi)較為恒定，分別為168．74-2．56mHg和57．174-2．72mmHg，PH值則分別為7．52±0．61和7．14±O．17。兩

7、組之間存在統(tǒng)計學差異，P值均為0．00。4．腦微血管內(nèi)皮細胞缺氧后體積經(jīng)歷了一個動態(tài)變化的過程，缺氧后的短時間即2-4h體積減小，隨著缺氧時間的延長細胞體積開始增大，而且增大的變化也呈現(xiàn)時間依賴的趨勢，在實驗的終末階段即10．12h，細胞體積的衡量值已經(jīng)為體積最小時的1．5倍。5．缺氧4h內(nèi)BMEC細胞培養(yǎng)液中LDH濃度沒有變化，但缺氧6h后，LDH始終呈現(xiàn)增高的趨勢。6．腦微血管內(nèi)皮細胞內(nèi)的鈣離子在極短時間(30min)內(nèi)迅速增高，而

8、且?guī)缀趿⒓催_到高峰。在缺氧后的4h內(nèi)，鈣離子波盡管有小幅的波動，但始終維持在高水平。7．低氧發(fā)生后的較長時間內(nèi)(2h-10h)，小分子量示蹤劑FLU通過血腦屏障的通透量并沒有太大的變化。而在缺氧時間延長到12h，F(xiàn)LU的通透量增加。8．低氧后緊密連接蛋白ZO．1、Occludin的分布由細胞膜上遷移到細胞漿內(nèi)和細胞核中。Occludin在低氧12h，mRNA表達降低，ZO．1在mRNA水平無變化。蛋白水平，兩者表達都無明顯改變。9．星形

9、膠質(zhì)細胞AQP4免疫熒光染色結(jié)果提示，AQP4在體外培養(yǎng)的膠質(zhì)細胞的胞漿和胞膜上都有表達，隨著缺氧時間的延長AQP4的細胞定位沒有明顯的變化。10．缺氧進行到4h-6h時AQP4mRNA表達增加，缺氧8h-12hAQP4mRNA表達又恢復到正常狀態(tài)。從PVDF膜上的蛋白表達染色可以發(fā)現(xiàn)，缺氧4h-6hAQP4的表達比正常條件時明顯增高，隨著缺氧時間的延長AQP4的表達再次下降到正常水平。 結(jié)論：1.通過腦微血管內(nèi)皮細胞與l型星形

10、膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)在涂有鼠尾膠的多孔酯膜的兩側(cè)，能夠形成與在體血腦屏障類似的結(jié)構，并具有在體屏障的限制物質(zhì)通透、酶屏障的功能。這一模型適合用于BBB物質(zhì)轉(zhuǎn)運和BBB細胞功能特性方面的研究。2．溫和缺氧條件下，低氧的發(fā)生一細胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高一細胞外液PH值降低一細胞體積增大一細胞死亡，一系列事件的發(fā)生，存在一定的時間依賴性。提示早期干預缺氧后可能事件的發(fā)生，可以減輕血腦屏障的第一關一BMEC的損傷，為延緩血腦屏障的開放和血管源性腦水腫的