1、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)絕大多數(shù)是由Ⅰ型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)引起的全球流行的傳染病，并成為人類主要的致死性疾病之一。據(jù)2005年聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署和世界衛(wèi)生組織的最新估計，自1981年首次發(fā)現(xiàn)HIV-1感染者以來，全球感染者累計7，000萬人以上，現(xiàn)存人數(shù)4，030萬，每年約新增感染者490萬。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)雖能降低部分患者病毒含量，延緩病情發(fā)展，改善癥狀，但因費用高、藥物副作用大使許多患者難以耐受

2、，也不能為大多數(shù)患者接受(特別是發(fā)展中國家患者)，更為重要的是HAART不能完全清除病毒。所以尋找有效HIV-1疫苗是目前迫切解決的問題。大量研究證明細胞免疫特別是HIV-1特異性CTL應(yīng)答反應(yīng)在控制HIV-1感染中起關(guān)鍵作用。故研發(fā)以增強HIV-1特異性CTL效應(yīng)為目的的疫苗具有很大潛力。開發(fā)此類疫苗首要的任務(wù)是確定能誘導(dǎo)強的HIV-1特異性CTL應(yīng)答并具有廣泛免疫原性的特異性表位。有效的HIV-1特異性CTL應(yīng)答不僅由抗原結(jié)構(gòu)決定，

3、同時受到HLA-Ⅰ等位基因限制，可見，篩選和鑒定具有強的和廣泛作用的HIV-1特異性CTL表位其中研究表位的HLA-Ⅰ類分子限制性是不可缺少的工作。不同人群HLA-Ⅰ等位基因的分布頻率不同，決定不同人群對HIV-1的CTL應(yīng)答模式不同，所以在不同人群開展HIV-1特異性CTL應(yīng)答研究十分必要。中國作為世界人口最多的國家，存在許多潛在的HIV-1蔓延危險因素，2003年底統(tǒng)計估計已有84萬人感染HIV-1，開發(fā)有效疫苗是阻止HIV-1感染

4、的最佳途徑。HLA-A*11等位基因型在中國人群中有較高的分布頻率，多次流行病學(xué)調(diào)查顯示在中國人群中分布頻率大于20％，而在白種人和黑人中分布頻率較低。對HLA-A11類分子限制的HIV-1特異性CTL表位的確定將對研發(fā)針對中國人群促使特異性CTL應(yīng)答的HIV-1疫苗具有重要的現(xiàn)實意義。 因HIV-1B亞型在中國存在廣泛流行，所以本研究選擇HIV-1B亞型感染者為研究對象，用ELISPOT法檢測覆蓋HIV-1B全基因序列肽庫誘導(dǎo)

5、的CTL應(yīng)答反應(yīng)，分析中國人群HIV-1B感染者HIV-1特異性CTL應(yīng)答特征，同時分析CTL應(yīng)答效應(yīng)與CD4+T細胞計數(shù)及病毒載量的相關(guān)性，進一步確定免疫優(yōu)勢應(yīng)答區(qū)域。選擇兩位攜帶HLA-A*11等位基因型的HIV-1B感染者，將ELISPOT和細胞內(nèi)因子染色法相結(jié)合，根據(jù)培養(yǎng)的EB病毒轉(zhuǎn)染的B-LCL攜帶的HLA-Ⅰ基因型與CTL之間的匹配和不匹配關(guān)系確定表位的HLA-A11類分子的限制型。為篩選研發(fā)針對中國人群的HIV-1疫苗所需

6、表位奠定基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.選擇50例HIV-1B感染者為研究對象，用ELISPOT法檢測覆蓋HIV-1B全基因序列肽庫誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答反應(yīng)發(fā)現(xiàn)：應(yīng)答頻率較高和應(yīng)答效應(yīng)較強的多肽主要分布在Gag、Nef蛋白區(qū)，和文獻報道的對白種人群和非洲人群觀察的結(jié)果相似，但從每個蛋白區(qū)和單個肽段分析存在明顯差異。 2.CTL應(yīng)答效應(yīng)與CD4+T細胞計數(shù)(流式細胞儀測定)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：Gagp17/Gagp24/Gag

7、特異性CTL應(yīng)答反應(yīng)強度與CD4+T細胞計數(shù)存在明顯的正相關(guān)性，即CTL應(yīng)答反應(yīng)能力越強，患者CD4+T細胞計數(shù)水平越高。整體CTL應(yīng)答強度也與CD4+T細胞計數(shù)水平呈明顯的正相關(guān)性。CTL應(yīng)答效應(yīng)與血漿病毒載量(熒光定量RT-PCR測定)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：Gagp24/Gag特異性CTL應(yīng)答反應(yīng)強度與病毒載量呈負相關(guān)性，即CTL應(yīng)答能力越強，病毒載量越低。但整體分析HIV-1特異性CTL應(yīng)答強度與病毒載量沒有發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性。

8、3.選擇兩例攜帶HLA-A*11基因型HIV-1B感染者為研究對象，將已確定可誘導(dǎo)CTL應(yīng)答效應(yīng)的陽性肽段(15～20個氨基酸)進一步切割，并通過濃度稀釋法再次用ELISPOT法測定CTL應(yīng)答反應(yīng)，最終確定35個HIV-1特異性CTL表位(8～11個氨基酸)。此項工作為進一步確定HLA-A11類分子限制的HIV-1特異性CTL表位打下基礎(chǔ)。 4.根據(jù)兩例感染HIV-1B研究對象攜帶的HLA-Ⅰ等位基因型，EB病毒體外誘導(dǎo)B淋巴細

9、胞，建立永生化的B淋巴母細胞系(B-LCL)。本課題共建立5株HIV-1感染者和5株健康志愿者的B-LCL。 5.用細胞內(nèi)因子染色法檢測HIV-1特異性CTL應(yīng)答效應(yīng)，通過PBMC中的效應(yīng)CTL細胞與靶細胞B-LCL攜帶的HLA-Ⅰ類分子之間匹配和不匹配關(guān)系確定誘導(dǎo)CTL應(yīng)答效應(yīng)的表位HLA-A11等位基因限制型。本實驗共確定了6個HLA-A11限制的表位，其中IIATDIQTK為新發(fā)現(xiàn)表位，位于Int蛋白區(qū)(Pol918～93

10、4)，其它5個在既往研究中通過反相免疫法或鉻釋放法等傳統(tǒng)方法確定，分別是P1784-91(TLYCVHQR),Nef73-82(QVPLRPMTYK)，Nef84-92(AVDLSHFLK)，Int179-188(AVFIHNFKRK)，Env202-210(SVITQACPK)。選擇10例攜帶HLA-A*11基因型的HIV-1感染者觀察對確定的HLA-A11類分子限制表位應(yīng)答頻率，結(jié)果提示應(yīng)答頻率較低。 綜上所述，中國人群HI