1、苯丙酮尿癥是一種能導(dǎo)致兒童智力發(fā)育落后的遺傳代謝性疾病,苯丙氨酸及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)蓄積是苯丙酮尿癥患者腦損傷的根本原因,但其導(dǎo)致腦損傷的確切機(jī)理不清楚.此外苯丙氨酸所致的腦損傷是一個很好的化學(xué)性腦損傷臨床模型,揭示其發(fā)病機(jī)制,不僅有助于苯丙酮尿癥的防治,更能夠?qū)ι窠?jīng)損傷的保護(hù)和再生研究提供啟迪.本課題主要研究苯丙氨酸及其衍生物對胚鼠皮層神經(jīng)元胞漿游離鈣的影響及其相關(guān)機(jī)制探索. 本課題組在基因芯片中發(fā)現(xiàn)高苯丙氨酸誘導(dǎo)可以增加cal

2、modulinI、Ca<'2+>/calmodulin-dependent protein kinase、L型Ca<'2+>channel的基因表達(dá),降低calmodulinⅡ、calcineurin、plasma membrane Ca<'2+>-ATPase 2b和2a的基因表達(dá),而這些基因的表達(dá)和胞漿游離鈣密切相關(guān),所以推測鈣可能參與了高苯丙氨酸誘導(dǎo)的腦損傷.為了驗(yàn)證這個假設(shè),本研究用共聚焦顯微鏡動態(tài)觀測高苯丙氨酸及其衍生物對神經(jīng)

3、元胞漿游離鈣的影響.在體外培養(yǎng)的胚鼠大腦皮層神經(jīng)元模型中,加入高濃度的苯丙氨酸(0.9mM)及其衍生物苯乳酸(0.5mM)均不同程度的降低胞漿游離鈣,而加入苯乙酸(1.1mM.)后胞漿游離鈣先升高,3分鐘以后開始下降.能導(dǎo)致胞漿游離鈣降低的疾病并不多見,所以本研究有必要探討相關(guān)機(jī)制.用EGTA+無鈣液代替標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液,同不加苯丙氨酸的樣本相比,加入苯丙氨酸的樣本胞漿游離鈣明顯降低,說明苯丙氨酸可以增加鈣離子外流；這種外流可以被細(xì)胞膜鈣泵

4、(PMCA)非特異的抑制劑vanadate阻斷,而不能被鈉鈣交換體(NCX)特異性抑制劑KBR7943和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(肌漿網(wǎng))鈣轉(zhuǎn)運(yùn)體(SERCA)特異性抑制劑thapsigargin阻斷,提示苯丙氨酸可能通過PMCA降低胞漿游離鈣.液閃儀測定苯丙氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞膜鈣轉(zhuǎn)運(yùn)能力增強(qiáng)和PMCA酶活性增高證實(shí)了這個結(jié)論.Vanadate在抑制PMCA的同時也可以抑制SERCA,所以我們用特異的siRNA抑制PMCA,結(jié)果和vanadate相似.

5、 高濃度苯丙氨酸介導(dǎo)的腦損傷是一個慢性的長期的過程.在本研究中,我們用苯丙氨酸誘導(dǎo)神經(jīng)元2周,在第3d、7d、9d、14d共聚焦顯微鏡觀察胞漿游離鈣的水平,同時用液閃儀檢測PMCA鈣攝取能力和ATP酶水解法測定PMCA酶活性.結(jié)果發(fā)現(xiàn)PMCA酶活性和PMCA鈣攝取能力在第9d的時候開始下降,有意義的是胞漿游離鈣水平在第9d也開始下降. 鈣超載是公認(rèn)的神經(jīng)元損傷的諸多復(fù)雜機(jī)制之一,本研究發(fā)現(xiàn)高濃度苯丙氨酸短期誘導(dǎo)降低胞漿游離鈣,