1、RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是指雙鏈RNA特異性地誘發(fā)與其序列同源的mRNA分子被降解，從而抑制基因表達的現(xiàn)象，是一種特殊的轉(zhuǎn)錄后基因表達沉默(posttranscriptionalgenesilence，PTGS)現(xiàn)象。近年來在細胞和動物體系中利用小干擾RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)進行的抗腫瘤和抗病毒等的應(yīng)用研究表明，RNA干擾技術(shù)在疾病治療領(lǐng)域具有誘人的應(yīng)用前景。本實驗室曾

2、報道利用大腸桿菌發(fā)酵制備esiRNA(endoribonuclease-preparedsiRNAs)，并利用其在細胞體系中高效特異地抑制了乙型肝炎病毒的復(fù)制。本論文首先在以前的工作基礎(chǔ)上改進了在大腸桿菌中表達雙鏈RNA的表達載體的構(gòu)建方法，提高了雙鏈RNA的產(chǎn)量：進一步我們針對乙型肝炎病毒的不同基因制備了四種esiRNA，通過實驗篩選出具有最佳抑制效率的esiHBVP，并且證明esiHBVP對乙型肝炎病毒的抑制效率高于化學合成的小干擾

3、RNA；最后通過實驗我們還證明了來自C型乙型肝炎病毒的esiHBVP能夠高效抑制靶序列不完全一致的報告基因的表達，來自B型乙型肝炎病毒的esiHP9同樣可以高效特異地抑制靶序列一致性為87％的C型乙型肝炎病毒的復(fù)制。結(jié)果顯示esiRNA可以耐受一定程度的靶序列變異而不影響其抑制效率，我們推測esiHBVP能夠抑制在中國人群中占主導(dǎo)地位的B型和C型乙型肝炎病毒的復(fù)制。 論文第一章的工作中，改進了在大腸桿菌中生產(chǎn)雙鏈RNA的表達載體

4、的構(gòu)建方法以及es'tRNA的純化方法，在細胞體系中證明了利用這種方法純化得到的esiRNA不激活干擾素途徑，不引起非特異性基因表達的抑制。首先構(gòu)建了一個帶有間隔序列的表達載體，然后將目的基因分別以正向和反向連接到間隔序列的兩側(cè)，使得目的基因的正反義鏈在同一強啟動子調(diào)控下被轉(zhuǎn)錄，互補配對后形成雙鏈RNA。構(gòu)建的重組質(zhì)粒能夠在大腸桿菌中高效表達雙鏈RNA，與雙啟動子表達載體相比，雙鏈RNA的得率提高了約5倍。利用大腸桿菌RNaseⅡI對雙

5、鏈RNA進行酶切，酶切產(chǎn)物通過離子交換層析和分子篩層析分離純化，最終得到21bp左右的esiRNA。細胞實驗結(jié)果顯示esiRNA可以高效特異地抑制目的基因的表達。 第二章的工作中，證明了esiRNA比化學合成的siRNA能夠更加高效地抑制乙型肝炎病毒的復(fù)制。針對HBV的不同ORF制備了4種esiRNA，在HepG2細胞中篩選出對HBV抑制效率最高的esiRNA—esiHBVP，并且檢測了esiHBVP在動物體系中對HBV的抑制情

6、況。然后合成了一段文獻報道的對HBV抑制效率最好的siRNA，在細胞體系中比較了esiHBVP和合成的siRNA對靶基因表達的抑制情況，同時在動物體系中比較了esiHBVP和合成的siRNA對乙型肝炎病毒復(fù)制的抑制情況。在CHO細胞中，48小時的實驗結(jié)果顯示esiHBVP對報告基因HBsAg表達的抑制作用高于合成的siRNA。通過尾靜脈液壓法給藥esiHBVP和合成的siRNA，觀察它們對乙型肝炎病毒在ICR小鼠肝臟內(nèi)復(fù)制的抑制作用，與

7、沒有注射小干擾RNA的對照小鼠相比，兩種siRNA處理的小鼠肝臟內(nèi)的乙型肝炎病毒表面抗原、e抗原、C抗原的表達水平均被抑制，esiHBVP的抑制效率高于合成的siRNA。注射后的第一天，esiHBVP和合成的siRNA對HBsAg的抑制率分別為90％和33％，對HBeAg的抑制率分別是89％和45％。在第四天，與沒有注射小干擾RNA的對照小鼠相比，1μgesiHBVP處理過的小鼠血清中的病毒DNA拷貝數(shù)下調(diào)了82％，而1μgsiRNA處

8、理過的小鼠血清中的病毒DNA拷貝數(shù)僅下調(diào)了37％。結(jié)果表明，與合成的siRNA相比，esiHBVP在抑制效率和持續(xù)時間方面均顯示出明顯的優(yōu)越性。 第三章的工作中，從血清中擴增HBVP基因片段，將這些具有不同程度序列一致性的HBVP片段構(gòu)建到報告基因的3’非翻譯區(qū)，作為esiHBVP作用的靶序列，在CHO細胞中檢測esiHBVP對它們的抑制情況。結(jié)果表明esiHBVP可以同樣高效特異性地抑制含有不同程度變異的靶序列的報告基因的表達

9、。在此基礎(chǔ)上，我們制備了和HBVP序列差異最大的片段HP9對應(yīng)的esiRNA--esiHP9，分別在細胞體系和動物體系中檢測了esiHP9對與其序列一致性為87％的乙型肝炎病毒的抑制情況。在HepG2細胞中，esiHP9能夠劑量依賴性地抑制乙型肝炎病毒表面抗原的分泌表達，在用量為150ng時，esiHP9達到和esiHBVP基本一致的抑制效率。在單次轉(zhuǎn)染150ngesiHP9后，抑制率在以后的7天內(nèi)維持在80％左右。通過尾靜脈液壓法給藥