1、目的： 1、研究分析早發(fā)冠心病患者的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素、脂類代謝情況、冠狀動(dòng)脈病變特點(diǎn)。 2、研究散發(fā)早發(fā)冠心病患者中MEF2A Exon 7和Exon 11以及ACE 16Intron基因突變情況。 3、進(jìn)一步研究不同早發(fā)冠心病家系遺傳特點(diǎn)，進(jìn)而明確MEF2A和ACE基因突變與早發(fā)CAD的相關(guān)性。 4、研究早發(fā)冠心病患者中eNOS和ET-1水平的改變，進(jìn)而明確內(nèi)皮功能異常與早發(fā)CAD發(fā)病之間的聯(lián)系。

2、5、研究不同相關(guān)脂蛋白對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞MEF2A表達(dá)水平的影響。 6、構(gòu)建MEF2A真核表達(dá)載體，并明確該表達(dá)載體在細(xì)胞中能進(jìn)行相應(yīng)蛋白表達(dá)。 方法： 1、收集臨床資料，血管造影結(jié)果，對(duì)早發(fā)冠心病患者、非早發(fā)冠心病患者和非冠心病患者的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素、脂類代謝情況、冠狀動(dòng)脈病變特點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 2、在基因水平，采用片斷長(zhǎng)度多態(tài)性和直接測(cè)序的方法對(duì)所有研究對(duì)象(包括家系及散發(fā)病例)ACE 16Intron和MEF2

3、A Exon 7和Exon 11的突變情況進(jìn)行分析。 3、在蛋白水平，采用ELISA方法對(duì)所有研究對(duì)象外周血中eNOS水平和ET-1水平進(jìn)行檢測(cè)。 4、在mRNA水平，采用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR方法研究不同濃度LDL、HDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞MEF2A表達(dá)水平的影響。 5、在細(xì)胞水平，采用質(zhì)粒構(gòu)建、真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法明確特定MEF2A片斷在真核細(xì)胞中表達(dá)狀況。 結(jié)果： 1、早發(fā)CAD臨床特點(diǎn)：①傳統(tǒng)危險(xiǎn)

4、因素顯著少于非早發(fā)CAD；②吸煙和陽(yáng)性家族史比率顯著高，高血壓比率顯著低；③TG水平顯著高；④以急性冠脈綜合癥起病為主，并且以單支血管受累為主；⑤病例平均病變積分較低，輕度病變比率較高。有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、以非早發(fā)CAD病例為參照，對(duì)早發(fā)CAlD進(jìn)行冠心病傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素Logistic回歸發(fā)現(xiàn)早發(fā)CAD病例中陽(yáng)性家族史對(duì)導(dǎo)致疾病起顯著作用，吸煙起很重要的作用。 3、成功收集早發(fā)冠心病大家系2個(gè)，小家系3個(gè)。 4、在

5、我國(guó)漢族人群中，MEF2A Exon 7基因變異與早發(fā)CAD沒有相關(guān)性。 5、MEF2A Exon 11上發(fā)現(xiàn)有5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)：①1258～1290(cAG)n(n=4～11)，其CAG重復(fù)數(shù)的改變對(duì)早發(fā)CAD的發(fā)生可能沒有作用；②1291～1293CCG/-，其DD/DW基因型和D等位基因與CAD尤其是早發(fā)CAD的發(fā)生有關(guān)；③1303C/T為新發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)，在既往研究中從未報(bào)道；④1305G/A，其多態(tài)性與早發(fā)CAD沒有相關(guān)性；

6、⑤1353G/T，其TT基因型和T等位基因?qū)υ绨l(fā)CAD和CAD的發(fā)生有關(guān)。MEF2A Exon 11的1291～1293CCG/-，1305G/A和1353G/T三個(gè)位點(diǎn)各組間的分布均存在連鎖不平衡或強(qiáng)不平衡。1291～1293 CCG D+1305 G+1353T單倍型對(duì)早發(fā)CAD的發(fā)生明顯相關(guān)。 6、ACE 16Intron I/D多態(tài)位點(diǎn)的DD基因型和D等位基因與CAD的發(fā)生有關(guān)，但其與早發(fā)CAD的關(guān)系有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量

7、證實(shí)。 7、在PCADLG01家系中，MEF2A Exon 11的1291～1293CCG/-DW雜合突變型和1353 G/T的TT純合突變很有可能是導(dǎo)致其眾多家系成員發(fā)生早發(fā)CAD的病因。然而MEF2A Exon 11和ACE 16Intron的突變?cè)诹硗鈳讉€(gè)家系中沒有明顯相關(guān)性。 8、eNOS水平：①早發(fā)CAD組<非早發(fā)組<正常對(duì)照組，有顯著差異；②其與病變嚴(yán)重程度和病變血管支數(shù)呈負(fù)相關(guān)，但是未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義；③

8、與吸煙狀態(tài)呈顯著負(fù)相關(guān)；④去除吸煙的混雜因素后，eNOS水平在三組間仍然有顯著差異(早發(fā)CAD組<非早發(fā)組<正常對(duì)照組)。 9、ET-1水平：①早發(fā)CAD組>非早發(fā)CAD組和正常對(duì)照組，有顯著差異；②非早發(fā)組>正常對(duì)照組，但未能達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異；③其與病變嚴(yán)重程度和病變血管支數(shù)呈正相關(guān)，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義。 10、eNOS水平和ET-1水平的關(guān)系：呈負(fù)相關(guān)性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 11、體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，用熒光定量

9、RT-PCR檢測(cè)MEF2A表達(dá)水平：①證實(shí)熒光定量RT-PCR是一種新的更為靈敏、高效的研究手段來(lái)探討危險(xiǎn)因素對(duì)心血管系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)的影響；②人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中MEF2A的表達(dá)顯著高于外周血細(xì)胞；③LDL刺激能顯著降低人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MEF2A基因的表達(dá)水平，HDL作用與其相反。作用內(nèi)皮細(xì)胞6 h和12 h此效果不顯著，24 h后明顯，該作用呈明顯的劑量依賴性。 12、成功構(gòu)建的MEF2A真核表達(dá)載體在內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞中均可以表

10、達(dá)。 結(jié)論： 1、本實(shí)驗(yàn)從臨床水平觀察到：較非早發(fā)CAD，早發(fā)CAD的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素較少，吸煙、冠心病陽(yáng)性家族史和TG水平升高可能在其發(fā)生過(guò)程中起了很重要的作用。早發(fā)CAD往往發(fā)病較急，側(cè)支循環(huán)來(lái)不及建立，預(yù)后較差。 2、本實(shí)驗(yàn)從基因水平發(fā)現(xiàn)：國(guó)外已報(bào)道的MEF2A Exon 7多態(tài)性位點(diǎn)與在我國(guó)漢族人群早發(fā)CAD的發(fā)生無(wú)明顯相關(guān)；但MEF2A Exon 11多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與早發(fā)CAD的發(fā)生明顯相關(guān)；ACE 16I

11、ntron的多態(tài)性與CAD的發(fā)生明顯相關(guān)，但是與早發(fā)CAD的關(guān)系有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量證實(shí)。早發(fā)CAD在不同人群，不同家系中具有遺傳異質(zhì)性。 3、本實(shí)驗(yàn)從血清學(xué)水平觀察到：早發(fā)CAD組eNOS較低，ET-1水平較高，內(nèi)皮功能失調(diào)很可能是引起早發(fā)CAD的病理基礎(chǔ)。 4、LDL、HDL除了在脂質(zhì)代謝中起作用外，還可能會(huì)影響MEF2A基因的表達(dá)。 5、可以將MEF2A載入到真核表達(dá)載體，并在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，將來(lái)完全可以以