1、第一部分 攜帶Mfn2基因不同結(jié)構(gòu)序列的重組腺病毒的構(gòu)建、擴(kuò)增和純化
　　 1.目的
　　 采用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建、制備、鑒定、擴(kuò)增和純化含線粒體融合素2基因（Mitofusin 2，Mfn2）不同結(jié)構(gòu)序列的重組腺病毒。
　　 2.方法
　　 利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增大鼠Mfn2不同區(qū)段的互補(bǔ)DNA（cDNAs），將PCR產(chǎn)物連接到TA克隆載體（pCR8/GW/TOPO）上，篩選出含有正確片段的質(zhì)

2、粒。利用Gateway方法將含有正確片段的重組質(zhì)粒與腺病毒目的質(zhì)粒（pAd/CMV/V5-DEST），在LR Clonase的幫助下進(jìn)行重組反應(yīng)。用PacI將所得到的重組腺病毒載體切開(kāi)，再利用脂質(zhì)體（Lipofectamine 2000）包裝后轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，產(chǎn)生重組的腺病毒。經(jīng)測(cè)序鑒定無(wú)誤后進(jìn)行大量擴(kuò)增，利用氯化銫密度梯度離心法，超高速離心純化病毒，分裝凍存于-80 ℃中。用紫外分光光度儀測(cè)定病毒液光密度（OD）值，計(jì)算病毒滴度。

3、采用Western blot方法檢測(cè)目的基因在大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）中的表達(dá)。
　　 3.結(jié)果
　　 8種目的基因結(jié)構(gòu)序列（1A、2A、3A、4A、5A、6A、7A、8A）正確，通過(guò)PCR鑒定可檢測(cè)到相應(yīng)條帶。8種重組腺病毒的滴度分別為27.8×109 pfu/ml、24×109 pfu/ml、19×109 pfu/ml、30.8×109 pfu/ml、6.7×109 pfu/ml、12.7×109 pfu/m

4、l、27.6×109 pfu/ml、11.8×109 pfu/ml。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示相應(yīng)的Mfn2蛋白表達(dá)。
　　 4.結(jié)論
　　 利用DNA重組技術(shù)可成功構(gòu)建攜帶Mfn2基因不同結(jié)構(gòu)序列的重組腺病毒，并通過(guò)擴(kuò)增和純化獲得大量高滴度的病毒液，為進(jìn)一步研究其對(duì)VSMCs增殖和凋亡的影響奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分 Mfn2基因不同結(jié)構(gòu)序列對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　 1.目的<

5、br>　　 研究大鼠線粒體融合素2基因（Mfn2）不同結(jié)構(gòu)序列對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）增殖和凋亡的影響，尋找能有效抑制VSMCs增殖和促進(jìn)凋亡的最小cDNA（scDNA），并探討其相關(guān)的信號(hào)通路。
　　 2.方法
　　 利用攜帶Mfn2基因不同結(jié)構(gòu)序列的重組腺病毒感染大鼠VSMCs。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法、水溶性四氮唑鹽（WST-8，CCK-8）法比較其對(duì)VSMCs增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)比較各組細(xì)胞周期的變化；流式細(xì)

6、胞術(shù)和細(xì)胞凋亡ELISA觀察各組對(duì)VSMCs凋亡的影響；Western blot法分析各組磷酸化Raf-1（p-Raf-1）、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表達(dá)的變化。
　　 3.結(jié)果
　　 細(xì)胞計(jì)數(shù)和CCK-8結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Mfn2基因不同結(jié)構(gòu)序列對(duì)VSMCs的增殖均有不同程度的抑制作用，其中以1A、4A和8A的抑制效果最明顯；流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果表明，Mfn2基

7、因不同結(jié)構(gòu)序列較對(duì)照組均能不同程度使VSMCs生長(zhǎng)停滯于G0/G1期，其中以1A、4A和8A最為明顯，進(jìn)入S期的細(xì)胞比例分別為（59.85±3.26）％、（34.73±2.65）％和（60.73±2.69）％；流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，1A、4A和8A均有明顯的促VSMCs凋亡作用，且呈時(shí)間依賴性（48h-72h）；細(xì)胞凋亡ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，1A、4A和8A 均有顯著的促V

8、SMCs凋亡作用；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，1A、4A和8A的p-Raf-1、p-ERK1/2和p-Akt表達(dá)水平較對(duì)照組均有明顯降低。
　　 4.結(jié)論
　　 與Mfn2全長(zhǎng)序列（8A，Adv-Mfn2）和去除穿膜區(qū)的Mfn2序列（4A，Adv-tMfn2）相比，Mfn2最小結(jié)構(gòu)序列1A同樣具有顯著抑制VSMCs增殖的作用，使細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，這一作用主要是使Ras-Raf-ERK1/2通路受到抑制

9、，p-Raf-1和p-ERK1/2的表達(dá)下調(diào)，從而發(fā)揮抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用。此外，1A也具有促VSMCs凋亡的作用，該作用主要是通過(guò)抑制Ras-PI3K-Akt信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)。
　　 第三部分Mfn2基因相關(guān)合成肽對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　 1.目的
　　 研究Mfn2基因相關(guān)合成肽（MRSP）對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）增殖和凋亡的影響，并探討其相關(guān)的信號(hào)通路。
　　 2.方法

10、
　　 在Mfn2最小功能序列1A的C端加上TAT穿膜多肽，人工合成MRSP。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法、水溶性四氮唑鹽（WST-8，CCK-8）法觀察不同濃度的MRSP（1 μM、10μM、25μM、50μM、100μM）對(duì)VSMCs增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)比較不同濃度MRSP對(duì)VSMCs細(xì)胞周期的影響；細(xì)胞凋亡ELISA和流式細(xì)胞術(shù)觀察MRSP對(duì)VSMCs凋亡的影響；Western blot法分析各組磷酸化Raf-1（p-Raf-1）、磷

11、酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表達(dá)的變化。
　　 3.結(jié)果
　　 人工合成MRSP為白色凍干粉末，純度97.2％，分子量3305，水溶性良好（PBS中的溶解度為1mg/ml）。細(xì)胞計(jì)數(shù)和CCK-8結(jié)果均顯示，與對(duì)照組相比，MRSP在10μM～100μM范圍內(nèi)可成劑量和時(shí)間依賴性的抑制VSMCs的增殖。流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果表明，不同濃度的MRSP（10μM、25μM、50μM）較

12、對(duì)照組均能使VSMCs生長(zhǎng)停滯于G0/G1期，G0/G1期的細(xì)胞比例分別為（24.90±3.46）％、（36.85±3.57）％和（62.45±2.83）％；流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)（24h、48h、72h），25μM MRSP可有效誘導(dǎo)VSMCs的凋亡，作用72h時(shí)的細(xì)胞凋亡率為（30.4±2.1）％；細(xì)胞凋亡ELISA結(jié)果表明，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，25μM MRSP與對(duì)照組

13、相比有顯著的促VSMCs凋亡作用；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，MRSP可成濃度依賴性（10μM、25μM、50μM）的抑制p-Raf-1、p-ERK1/2和p-Akt的表達(dá)水平。
　　 4.結(jié)論
　　 根據(jù)Mfn2的最小功能序列人工合成的MRSP具有顯著抑制VSMCs增殖的作用，使細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，這一作用主要是使Ras-Raf-ERK1/2通路受到抑制，p-Raf-1和p-ERK1/2