1、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)在全球人口中的感染率超過50％,已被確定為慢性胃炎、消化性潰瘍的重要致病菌,并被世界衛(wèi)生組織列為胃癌的Ⅰ類致癌因子。
　　表位是抗原分子中決定抗原特異性的關(guān)鍵部分,合理組合優(yōu)勢表位,可誘導(dǎo)出比原始抗原更為高效和特異的免疫應(yīng)答。H.pylori感染導(dǎo)致機(jī)體對H.pylori自身天然抗原產(chǎn)生免疫耐受,選擇H.pylori保護(hù)性抗原的優(yōu)勢表位來構(gòu)建表位疫苗,有可能打破免

2、疫耐受,從而達(dá)到免疫預(yù)防和清除H.pylori感染的目的。前期研究證實(shí),特異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答在抗H.pylori感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答中至關(guān)重要。本研究通過構(gòu)建H.pyloriTh表位疫苗,采用先免疫后攻毒以及先感染后治療兩種方式,在動物模型上對疫苗的預(yù)防和清除的保護(hù)效果進(jìn)行評價,并探討相應(yīng)的免疫應(yīng)答機(jī)制。主要研究方法、結(jié)果和結(jié)論如下:
　　1.幽門螺桿菌Th表位的篩選和疫苗的設(shè)計(jì)
　　通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測并篩選H.p

3、ylori保護(hù)性抗原HpaA、CagA和UreB的優(yōu)勢Th表位,共篩選到17個表位肽。動力學(xué)模擬考察不同表位連接順序所構(gòu)成蛋白的動力學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定型,確定以HpaA表位-CagA表位-UreB表位的連接順序來構(gòu)建Th表位疫苗Epivac。
　　2.幽門螺桿菌Th表位疫苗的構(gòu)建、表達(dá)和純化
　　構(gòu)建疫苗蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-epivac,轉(zhuǎn)化至BL21(DE3),經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)和純化,獲得目的蛋白Epivac,HPLC分

4、析蛋白純度在90%以上。相同的技術(shù)方法制備含分子內(nèi)佐劑的疫苗蛋白LTB-epivac。
　　3.幽門螺桿菌Th表位疫苗的免疫保護(hù)效果評價及應(yīng)答分析
　　1)幽門螺桿菌Th表位疫苗免疫預(yù)防效果的評價及應(yīng)答分析
　　采用鼻腔滴注和皮下注射兩種免疫途徑,Epivac聯(lián)用不同佐劑對BALB/c小鼠進(jìn)行免疫,評價疫苗的免疫預(yù)防效果。結(jié)果顯示,單用疫苗以及聯(lián)用佐劑都可以有效預(yù)防H.pylori感染,且聯(lián)用佐劑效果更優(yōu)。此外,鼻腔滴

5、注發(fā)揮保護(hù)作用的時間點(diǎn)要早于皮下注射。ELISA檢測特異性抗體IgG、IgA的產(chǎn)生;Real-timeRTPCR和ELISA檢測脾淋巴細(xì)胞和胃組織細(xì)胞因子的表達(dá)變化;流式細(xì)胞術(shù)定量檢測抗原特異性CD4+T細(xì)胞的水平及其應(yīng)答特征。結(jié)果提示疫苗的保護(hù)作用與抗體應(yīng)答無關(guān),而主要依賴于疫苗誘導(dǎo)的系統(tǒng)性和局部的Th1型CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。
　　2)幽門螺桿菌Th表位疫苗免疫清除效果的評價及應(yīng)答分析:
　　利用BALB/c小鼠模型對表位

6、疫苗的免疫清除效果進(jìn)行評價。相對于未免疫組,疫苗免疫可以顯著降低小鼠胃內(nèi)H.pylori的定植量,具有一定的治療效果。通過分析小鼠抗體應(yīng)答的特征,推測疫苗的免疫清除作用可能與特異性Th1型細(xì)胞應(yīng)答密切相關(guān)。
　　4.幽門螺桿菌Th表位疫苗的初步安全性評價
　　通過內(nèi)毒素檢測、急性毒性試驗(yàn)和豚鼠最大化試驗(yàn)對疫苗的安全性進(jìn)行初步評價,結(jié)果顯示疫苗內(nèi)毒素低于限量,且鼻腔滴注和皮下注射兩種給藥方式不會引起機(jī)體損傷和過敏反應(yīng),初步說明