1、正常情況下氣管、支氣管上皮細胞和粘膜下腺分泌的粘液是機體固有免疫的重要組成部分,它對入侵氣道的各種異物、病原體具有屏障、清除作用。但在病理情況下,過度分泌的粘液是哮喘、慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)、支氣管擴張、囊性纖維化(Cystic fibrosis,CF)等慢性氣道疾病發(fā)病、死亡的常見原因,目前仍缺乏有效的治療手段。闡明氣道粘液合成的調(diào)控機制,將為氣道粘液

2、高分泌提供新的治療靶點,對開發(fā)有效抑制氣道粘液高分泌的新藥物具有重要意義。粘蛋白MUC5AC是氣道粘液的主要成分,所以研究其表達的調(diào)控機制尤為重要。多種細菌均可誘導氣道粘蛋白MUC5AC表達上調(diào),包括致呼吸道感染的常見細菌-銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)及其胞壁成分脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),但目前PA-LPS上調(diào)氣道粘蛋白MUC5AC表達的分子機制尚未完全闡明。最近有研究

3、發(fā)現(xiàn)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)可通過TACE→TGF-α→EGFR信號通路介導香煙煙霧、中性粒細胞彈性蛋白酶(Neutrophil elastase,NE)上調(diào)氣道上皮細胞粘蛋白MUC5AC的表達;本實驗室既往研究發(fā)現(xiàn)可能存在TLR4-PKC-Duox1信號通路調(diào)控PA-LPS誘導的氣道上皮細胞ROS合成,進而通過ROS及其下游的信號通路TACE-TGF-α-EGFR調(diào)控粘蛋白MUC5AC的表達。以

4、上研究提示氧化應(yīng)激在PA-LPS誘導氣道MUC5AC高表達中具有重要作用。核因子相關(guān)因子2(NF-E2-related factor2,Nrf2)是細胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)中樞,其活性主要由Keap1(Keleh-like ECH-associated protein 1)負性調(diào)節(jié)。生理狀態(tài)下,Nrf2與Keap1相耦聯(lián),后者與胞漿肌動蛋白結(jié)合而被錨定在胞漿,通過泛素介導的蛋白降解系統(tǒng)維持Nrt2的基礎(chǔ)水平;而在氧化應(yīng)激作用下,Nrf2

5、與Keap1解耦聯(lián)、轉(zhuǎn)移入核,與其專性伴侶-小Maf蛋白結(jié)合成異二聚體,識別并結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)上GCTGAGTCA位點,啟動ARE調(diào)控的抗氧化酶基因,如:谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase,GST)、NADP(H)醌氧化還原酶[NADP(H):quinine oxidoreductase,NQO1]、谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞單位[ca

6、talytic subunits of γ-glutamyleysteine ligase(GCLc)]及血紅素氧化酶1(heme oxygenase-1,HO-1)等表達,增加細胞對氧化應(yīng)激的抗性。近年來大量研究顯示Keap1/Nrf2信號通路參與了腫瘤、老化、哮喘、急性肺損傷、肺纖維化、動脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性變、慢性炎癥和自身免疫病等疾病的病理生理過程。既往研究表明化學合成的三萜化物CDDO,通過增強Nrf2活性、抑制NF-κB活

7、化,可以減輕LPS誘導的肺囊性纖維化小鼠模型的氣道炎癥;在Nrf2敲除的實驗性敗血癥小鼠模型中,LPS刺激30分鐘內(nèi),小鼠肺部炎癥加重、大量與天然免疫反應(yīng)有關(guān)的前炎癥因子產(chǎn)生,感染性休克的死亡率明顯增高。上述研究雖表明Keap1/Nrf2信號通路能有效抑制LPS誘導的肺部炎癥,但對于該信號通路是否參與調(diào)控PA-LPS誘導氣道MUC5AC表達目前國內(nèi)外未有報道。本課題擬以氣道上皮細胞A549為研究對象,研究Keap1/Nrf2信號通路在P

8、A-LPS上調(diào)氣道MUC5AC中的作用,以闡明氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)PA-LPS誘導氣道粘蛋白MUC5AC表達的機制。
　　 第一部分:銅綠假單胞菌脂多糖誘導人體氣道上皮細胞系A(chǔ)549細胞MUC5AC以及Nrf2下游抗氧化基因(NQO1、GCLC、GST-pi、HO-1)的表達
　　 目的:探討銅綠假單胞菌脂多糖(PA-LPS)誘導A549細胞粘蛋白MUC5AC以及Nrf2下游抗氧化基因(NQO1、GCLC、GST-pi、HO-1

9、)表達。
　　 方法:不同濃度(5ug/mL、10ug/mL和15 ug/mL)PA-LPS干預(yù)體外培養(yǎng)的A549細胞不同時間(0h、8h、12h、24h),用實時熒光PCR(Q-PCR)分別檢測干預(yù)后MUC5AC mRNA的表達水平,以明確PA-LPS是否能上調(diào)A549細胞MUC5AC的表達,以及PA-LPS最佳干預(yù)濃度和時間。干預(yù)24h后采用Western Blot檢測MUC5AC以及抗氧化因子蛋白的表達。
　　 結(jié)

10、果:10ug/mL PA-LPS干預(yù)24h后,A549細胞粘蛋MUCSAC mRNA及蛋白水平均明顯上調(diào)(p＜0.01);Keap1/Nrf2下游抗氧化基NNQO1、GCLC和GST-pi的表達上調(diào),以NQO1顯著(p＜0.05);HO-1表達下調(diào)(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:①銅綠假單胞菌脂多糖(PA-LPS)可上調(diào)A549細胞粘蛋白MUC5AC的表達;②PA-LPS可調(diào)控Keap1/Nrf2及其下游抗氧化基NNQO1、GC

11、LC、GST-pi和HO-1的表達;③Keap1/Nrf2信號通路可能參與調(diào)控PA-LPS誘導人體氣道上皮細胞A549細胞粘蛋白MUC5AC的表達。
　　 第二部分:Keap1/Nrf2信號通路在銅綠假單胞菌脂多糖誘導人體氣道上皮細胞系A(chǔ)549細胞MUC5AC表達中的作用
　　 目的:探討Keap1/Nrf2信號通路在PA-LPS上調(diào)A549細胞粘蛋白MUC5AC表達中的作用。
　　 方法:體外培養(yǎng)人體氣道上皮細

12、胞系A(chǔ)549細胞,分別用不同劑量Nrf2 siRNA和Nrf2過表達質(zhì)粒(pCDNA3-Myc3-Nrf2)轉(zhuǎn)染該細胞,轉(zhuǎn)染24h后,去血清過夜培養(yǎng),加入10ug/mL LPS干預(yù)不同時間,Q-PCR檢測該細胞Nrf2及MUC5AC mRNA的表達情況以確定最佳轉(zhuǎn)染劑量和PA-LPS干預(yù)時間。同前方法檢測PA-LPS干預(yù)Nrf2siRNA和Nrf2過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后A549細胞MUC5AC、Keap1/Nrf2及其下游氧化基因mRNA及蛋

13、白的表達情況。
　　 結(jié)果:Nrf2 siRNA有效抑制A549細胞Nrf2 mRNA的表達,下調(diào)其mRNA表達水平約82％;pCDNA3-Myc3-Nrf2明顯增強A549細胞Nrf2 mRNA的表達,上調(diào)其mRNA表達水平200余倍。與對照組相比,Nrf2 siRNA明顯增強PA-LPS對A549細胞MUC5ACmRNA及蛋白表達的上調(diào)(p＜0.01);pCDNA3-Myc3-Nrf2明顯抑制PA-LPS對A549細胞MUC