1、目的： 1.采用Taqman-MGB探針技術(shù)，建立實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-RT-PCR)檢測(cè)Foxp3mRNA的方法。 2.對(duì)前列腺癌患者(PCa)、前列腺增生(BPH)患者、復(fù)發(fā)前列腺癌(PCaR)、治療后前列腺癌患者(PCaT)及健康對(duì)照外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)的Foxp3mRNA進(jìn)行熒光定量檢測(cè)并探討Foxp3表達(dá)變化的意義。 方法： 1.Foxp3mRNA的FQ-RT-PCR方

2、法建立：根據(jù)Genebank的Foxp3mRNA(NM_014009)序列，在Foxp3基因的外顯子6和7之間設(shè)計(jì)一對(duì)引物和一條Taqman-MGB探針，優(yōu)化反應(yīng)體系。 2.標(biāo)準(zhǔn)品的制備：用pMD18-T載體與普通PCR擴(kuò)增所得的Foxp3cDNA片段進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，將標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，以拷貝數(shù)的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，循環(huán)域值(Ct)為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 3.方法學(xué)評(píng)價(jià)：包括該

3、方法的靈敏性、特異性和重復(fù)性等。 4.臨床應(yīng)用研究：收集45例初診PCa、29例治療后前列腺癌、15例前列腺癌復(fù)發(fā)、54例良性前列腺增生(BPH)以及13例健康對(duì)照的PBMCs，對(duì)這些病例PBMCs的Foxp3mRNA含量進(jìn)行的檢測(cè)，并分析Foxp3mRNA的表達(dá)量在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的意義。 結(jié)果： 1.成功建立了熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)Foxp3mRNA的方法，本方法檢測(cè)靈敏度為25拷貝/反應(yīng)，線(xiàn)性范圍

4、為25～2.5x109拷貝/反應(yīng)，Ct值與拷貝數(shù)之間具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.995。批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為3.02～4.13％和4.52～5.37％，重復(fù)性較好。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序分析，結(jié)果進(jìn)行BLAST同源比較，擴(kuò)增片段與NM_014009序列符合率為100％。 2.PCa組Foxp3mRNA表達(dá)量的中位數(shù)(Foxp3mRNA/GAPDHmRNA×10000)為8.80(3.31～10.76)和PCaR組[20.39(

5、4.79～26.60)]，都明顯高于BPH組[2.93(1.32～4.17)]、PCaT組[2.36(0.48～3.38)]及健康對(duì)照組[2.33(0.76～3.31)]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；PCa組與PCaR組的Foxp3mRNA表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；BPH組、PCaT組的Foxp3mRNA表達(dá)量較健康對(duì)照組的不升高，三組之間的表達(dá)量差異亦不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 3.PCa組按病理

6、Gleason評(píng)分分成高、中、低三組，三組間方差不齊(P＜0.05)，故采用秩和檢驗(yàn)比較差別。三組間Foxp3mRNA表達(dá)量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。再對(duì)評(píng)分與Foxp3mRNA表達(dá)量進(jìn)行Spearman’s相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)-0.235，P＞0.05，F(xiàn)oxp3mRNA表達(dá)量與Gleason評(píng)分高低無(wú)明顯關(guān)系。但從數(shù)值上看隨著Gleason評(píng)分的增加Foxp3mRNA表達(dá)水平有下降趨勢(shì)。PCa不同臨床分期間Foxp3mRNA表達(dá)量

7、差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。將PCa組以是否發(fā)生骨轉(zhuǎn)移分成兩組，比較兩組間差異，兩組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論： 1.熒光實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)Foxp3mRNA的方法具有靈敏、特異、準(zhǔn)確、重復(fù)性好等特點(diǎn)。 2.Foxp3mRNA在PCa組和復(fù)發(fā)前列腺癌組(PCaR)的PBMCs中高表達(dá)，為研究Foxp3mRNA在PCa的發(fā)生發(fā)展中腫瘤免疫方面所起的作用提供部分實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 3.F