1、目的： 1.第一部分 觀察由HIV-1的反式激活蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(TAT-proteintransductiondomain，TAT-PTD)攜帶的人酸性成纖維細(xì)胞生長因子(humanacidicFibroblastGrowthFactor，aFGF)和6×組氨酸的融合蛋白TAT-aFGF-His通過角膜滴入給藥進(jìn)入視網(wǎng)膜組織的情況。并構(gòu)建融合蛋白aFGF-His作為對(duì)照蛋白。 2.第二部分 眼角膜滴用融合蛋白

2、TAT-aFGF-His對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性視網(wǎng)膜缺血再灌注(retinalischemia-reperfusion，RIR)損傷的治療作用，并探討其作用機(jī)理。 方法： 1.第一部分 PCR擴(kuò)增aFGF-His基因片段，利用BglⅡ和BamHⅠ的同尾酶特性，用NdeⅠ和BglⅡ雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物并與NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切處理的質(zhì)粒pET-3c相連，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，氨卞青霉素篩選陽性克隆。抽提經(jīng)測(cè)序鑒定序列正確的重

3、組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，利用氨卞抗性篩選出轉(zhuǎn)化子。分別用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白TAT-aFGF-His和aFGF-His，cM離子交換及肝素親和兩步層析法分離純化蛋白。 健康SD大鼠36只隨機(jī)分為生理鹽水組(NS組)、aFGF-His組和TAT-aFGF-His組，每組12只，NS組滴入生理鹽水，aFGF-His組滴入2μgaFGF-His，TAT-aFGF-His組滴入2μgTAT-aFGF-His。大鼠給

4、藥后分別于10min、30min、1h、2h、4h和8h處死，每時(shí)間點(diǎn)2只，雙眼給藥。用6×His抗體，采用免疫組化SABC法檢測(cè)aFGF-His和TAT-aFGF-His在角膜和視網(wǎng)膜組織的分布情況。 2.第二部分 健康SD大鼠45只隨機(jī)分為生理鹽水治療組(簡稱A組)、aFGF-His治療組(簡稱B組)、TAT-aFGF-His治療組(簡稱C組)。各組大鼠均采用前房灌注加壓形成14.6kPa高眼壓，維持60min建立R

5、IR模型。再灌注開始后及每隔1d，A組滴入生理鹽水，B組滴入2μgaFGF-His，C組滴入2μgTAT-aFGF-His進(jìn)行治療。各組大鼠分別于再灌注1，3，7d處死，每時(shí)間點(diǎn)5只，每組右眼為實(shí)驗(yàn)眼，左眼為正常對(duì)照眼。動(dòng)物造模前及處死前行視網(wǎng)膜點(diǎn)圖(ERG)檢測(cè)，記錄ERGa波和b波波幅。光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化(HE染色)，記錄視網(wǎng)膜內(nèi)層(IRL)厚度和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)數(shù)目的變化。采用原位凋亡檢測(cè)法(TUNE

6、L)檢測(cè)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)和內(nèi)核層(INL)的細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果： 1.第一部分 正確構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒載體pET-aFGF-His。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，融合蛋白TAT-aFGF-His和aFGF-His的表達(dá)量分別占菌體總蛋白的30％和27％，均為可溶性表達(dá)。經(jīng)兩步層析純化后，獲得了純度大于95％的TAT-aFGF-His和aFGF-His蛋白。免疫組化結(jié)果表明，NS組、aFGF-His組在角膜和視網(wǎng)膜組織

7、均未見到His染色陽性細(xì)胞。TAT-aFGF-His組在10min、30min、1h、2h、4h、8h的角膜和視網(wǎng)膜組織均能見到陽性細(xì)胞，主要分布在角膜上皮細(xì)胞層和視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層。10min時(shí)有微量TAM-aFGF-His進(jìn)入視網(wǎng)膜組織，30min時(shí)TAT-aFGF-His在視網(wǎng)膜的分布達(dá)到高峰，8h時(shí)TAT-aFGF-His大部分被清除。 2.第二部分 ①ERG檢查：與A組相比，B組ERGa波和b波波幅在1，3，7d均

8、無明顯差異(P＞0.05)。與A和B組比較，再灌注3d，C組ERGa波波幅(149.6±26.33μv)明顯高于A組(25.6±7.40μv)和B組(49.8±5.89μv)(P＜0.01和P＜0.05)；再灌注3，7d，C組ERGb波波幅(194.8±38.92μv和334.0±67.52μv)明顯高于A組(62.0±15.41μv和145.2±22.51μv)和B組(60.8±8.07μv和152.8±22.16μv)(P＜0.05

9、)。 ②視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化：RIR損傷早期，IRL水腫增厚，GCL和INL均可見核固縮細(xì)胞，晚期RGCs數(shù)目減少，IRL萎縮變薄。與A組相比，B組在再灌注1d，IRL厚度有差異(P＜0.05)，而其余各時(shí)間點(diǎn)，RGCs數(shù)目和IRL厚度均無差異(P＞0.05)。與A和B組比較，再灌注1d，C組IRL水腫更嚴(yán)重(P＜0.05)，而RGCs數(shù)目均多于前兩組，但只與A組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；再灌注3d，C組與前兩組相比，IRL

10、厚度均無差異(P＞0.05)，而RGCs數(shù)目明顯多于前兩組(P＜0.01)；再灌注7d，C組IRL厚度大于前兩組(P＜0.05)，且RGCs數(shù)目均多于前兩組(P＜0.01)。 ③視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡：正常大鼠視網(wǎng)膜TUNEL染色陰性，A、B、C組視網(wǎng)膜GCL和INL均可見大量棕黃色陽性細(xì)胞，并隨再灌注時(shí)間的增加而減少。與A組相比，B組在再灌注各時(shí)間點(diǎn)的陽性細(xì)胞數(shù)均無顯著差異(P＞0.05)。與A和B組比較，再灌注1d，C組INI，

11、的陽性細(xì)胞與A組有差異(P＜0.05)，但與B組無顯著差異(P＞0.05)；再灌注3d，C組GCL和INL的陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于前兩組(P＜0.01)；再灌注7d，C組GCL的陽性細(xì)胞明顯少于前兩組(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.角膜滴用2μgaFGF-His蛋白不能進(jìn)入視網(wǎng)膜組織，TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域能有效攜帶aFGF-His(TAT-aFGF-His)穿透眼球血眼屏障進(jìn)入眼底到達(dá)視網(wǎng)膜組織。 2.成功構(gòu)建視網(wǎng)膜缺血