1、目的： 腺苷是腺嘌呤核苷酸代謝的中間產(chǎn)物，廣泛存在于全身各組織中，在組織缺氧時(shí)由ATP大量分解產(chǎn)生。心、腦、腎等組織急性缺氧時(shí)，腺苷作用于局部組織產(chǎn)生明顯的擴(kuò)血管作用，改善血供；組織慢性缺氧時(shí)，腺苷通過(guò)直接或間接的作用，促進(jìn)組織新生血管生成，有積極的代償作用。視網(wǎng)膜缺氧時(shí)也會(huì)產(chǎn)生視網(wǎng)膜新生血管，但后者嚴(yán)重威脅和破環(huán)視網(wǎng)膜功能，是目前致盲性眼病的主要原因之一。抑制新生血管生長(zhǎng)是治療此類增生性視網(wǎng)膜病變的關(guān)鍵。腺苷在視網(wǎng)膜組織的生理

2、作用目前還不是很清楚。近年來(lái)一系列體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)腺苷作用于細(xì)胞膜上的特異性腺苷受體，刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，對(duì)新生血管的生成有促進(jìn)作用。因此腺苷受體的缺失會(huì)影響血管生成和發(fā)育?，F(xiàn)已證實(shí)腺苷A2A受體在視網(wǎng)膜組織表達(dá)。本研究通過(guò)建立高氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變模型(Oxygen-inducedretinopathy，OIR)，結(jié)合視網(wǎng)膜鋪片及切片技術(shù)、免疫組化標(biāo)記和分子生物學(xué)方法，深入研究A2A受體基因敲除對(duì)OIR模型的視網(wǎng)膜病變的影響，以揭

3、示A2A受體在相對(duì)缺氧條件下對(duì)視網(wǎng)膜新生血管形成的影響。 方法： 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用遺傳背景C57BL/6的野生型(A2A+/+)和基因敲除型(A2A-/-)小鼠，均來(lái)自A2A基因敲除雜合子(A2A+/-)雌雄小鼠交配。小鼠的基因型鑒定采用PCR方法。 實(shí)驗(yàn)分組：1、建立高氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變模型，設(shè)立野生型空氣組和氧誘導(dǎo)組；2、研究A2A受體基因敲除對(duì)小鼠視網(wǎng)膜血管的影響，設(shè)立基因敲除空氣組和氧誘導(dǎo)組。 建立

4、模型：選取7日齡健康小鼠，隨機(jī)分為4組：野生型空氣組、氧誘導(dǎo)組和基因敲除空氣組和氧誘導(dǎo)組，每組40只?？諝饨M于正?？諝猸h(huán)境中飼養(yǎng)，氧誘導(dǎo)組置于氧氣濃度為(75％±2％)的氧箱中，5整天后(即于生后第12天，Postnatal12days，P12)返回正常空氣環(huán)境中飼養(yǎng)，建立高氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變動(dòng)物模型。 病理組織學(xué)檢查：各組小鼠分別于出生P12、P14、P17，和P21處死，取眼球。右眼行視網(wǎng)膜鋪片經(jīng)ADP酶染色，以觀察視網(wǎng)膜血

5、管形態(tài)改變；左眼行視網(wǎng)膜組織連續(xù)切片經(jīng)HE染色，計(jì)數(shù)內(nèi)叢狀層以內(nèi)非神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)和突破內(nèi)界膜細(xì)胞核數(shù)，以定量評(píng)估視網(wǎng)膜的增生反應(yīng)。 免疫組織化學(xué)檢查：采用PCNA、CD31、GFAP等免疫組化方法鑒別非神經(jīng)節(jié)細(xì)胞類型。PCNA標(biāo)記增殖期細(xì)胞，CD31標(biāo)記成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，GFAP標(biāo)記成熟星型膠質(zhì)細(xì)胞。 定量PCR技術(shù)：通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)視網(wǎng)膜組織VEGFmRNA表達(dá)。β-actin基因在不同樣本組織中的表達(dá)量

6、處于穩(wěn)定狀態(tài)，故可以將其基因產(chǎn)物的含量作為定量VEGF的內(nèi)參照物，并可以此來(lái)校正標(biāo)本之間RNA的質(zhì)量和逆轉(zhuǎn)錄效率的差異。本研究將VEGFmRNA的拷貝數(shù)與相對(duì)應(yīng)的β-actin基因的拷貝數(shù)相除來(lái)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，從而得出VEGF基因產(chǎn)物的相對(duì)定量。 結(jié)果： 1、與17日齡空氣對(duì)照組相比，同日齡野生型氧誘導(dǎo)組小鼠視網(wǎng)膜血管迂曲擴(kuò)張，大片無(wú)血管區(qū)形成，新生血管開始形成；非神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)和突破內(nèi)界膜的細(xì)胞核數(shù)均比空氣組顯著增加(P＜0

7、.001，n=20)。表明氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型建立成功。 2、與同日齡野生型氧誘導(dǎo)組相比，基因敲除型氧誘導(dǎo)組無(wú)血管區(qū)面積明顯減少，未見新生血管。非神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)和突破內(nèi)界膜的細(xì)胞核數(shù)分別下降了40％和80％，差別有顯著性意義(P＜0.001，n=20)?；蚯贸諝饨M與野生型空氣組相比均無(wú)顯著性差別(P＞0.05，n=20)。 3、PCNA免疫組化染色表明氧誘導(dǎo)組小鼠視網(wǎng)膜中的絕大多數(shù)的非神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和突破內(nèi)界膜的細(xì)胞為增殖

8、細(xì)胞；CD31和GFAP免疫組化染色表明在非神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和突破內(nèi)界膜的細(xì)胞中包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞。 4、VEGFmRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：與同齡的空氣組比較，野生型氧誘導(dǎo)組VEGFmRNA水平表達(dá)上調(diào)，兩者差異有顯著性意義(P＜0.05，n=8)；而基因敲除型氧誘導(dǎo)組的VEGFmRNA水平明顯低于野生型氧誘導(dǎo)組，兩組比較差異十分顯著(P＜0.01，n=8)。提示A2A受體基因敲除下調(diào)VEGFmRNA的表達(dá)。