1、胃癌占消化道腫瘤死亡人數(shù)的一半和各種惡性腫瘤死亡總數(shù)的1/5，死亡原因在于術(shù)后患者容易發(fā)生腹腔轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。術(shù)中、術(shù)后徹底消滅腹腔內(nèi)游離癌細胞和微小癌灶是預(yù)防復(fù)發(fā)，提高生存率的關(guān)鍵。腹腔內(nèi)溫熱灌注化療直接作用于腹腔內(nèi)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移部位，對預(yù)防胃腸道惡性腫瘤根治術(shù)后復(fù)發(fā)有一定作用。目前，術(shù)中、術(shù)后腹腔內(nèi)溫熱灌注化療已逐漸成為大多數(shù)學(xué)者公認的目前治療進展期胃腸道腫瘤的有效方法。吡柔比星(Pirarubicin，THP)日前主要應(yīng)用于乳腺癌、小細胞

2、肺癌、白血病和淋巴瘤的全身治療以及膀胱癌腔內(nèi)灌注，但在腹腔內(nèi)灌注溫熱化療方面的研究很少，特別是在術(shù)中使用THP進行溫熱化療方面的研究更少。本課題擬研究吡柔比星對胃癌細胞、組織的溫熱協(xié)同效應(yīng)和作用機制以及對裸鼠生存的影響。以了解吡柔比星在腹腔灌注化療中的應(yīng)用可能，指導(dǎo)臨床應(yīng)用。 目的：研究吡柔比星和溫熱協(xié)同對胃癌細胞和組織的體外作用，以及對胃癌細胞的增殖和侵襲的影響，探討吡柔比星和溫熱協(xié)同協(xié)同作用機制及對裸鼠生存率的影響。

3、 方法： 第一章吡柔比星與溫熱協(xié)同對胃癌細胞的體外作用研究。(1)人類胃癌細胞系MGC-803細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，使用THP、順鉑(DDP)、絲裂霉素(MMC)和氟尿嘧啶(5FU)處理進行實驗研究。THP濃度設(shè)定為25μg/ml、32μg/ml和40μg/ml，摸索THP腹腔灌注化療的最佳作用濃度；(2)在確定合適濃度的THP后，通過37.5℃、39℃、41℃、43℃和45℃五個溫度梯度處理，MTS-PMS比色法檢測細胞活性

4、，研究THP的熱效應(yīng)；(3)處理溫度設(shè)定為43℃和45℃，43℃處理時間為30min、60min、90min和120min；45℃處理時間30min、45min和60min；(4)在37℃和43℃加或不加32μg/mlTHP作用后，測定MGC-803細胞的生長曲線并計算細胞倍增時間，研究THP作用的時間效應(yīng)；(5)MGC-803細胞經(jīng)37℃、41℃、43℃、37℃+THP(32μg/ml)、41℃+THP(32μg/ml)、43℃+TH

5、P(32μg/ml)處理60min后，使用流式細胞儀測定熒光強度，Cellquest分析軟件進行細胞周期分析；(6)AnnexinV-FITC方法測定細胞凋亡。 第二章吡柔比星與溫熱協(xié)同對胃癌細胞增殖和侵襲的作用研究。(1)對數(shù)生長期MGC-803細胞經(jīng)37℃或43℃，32μg/mlTHP處理60min后，做軟瓊脂克隆形成實驗，評價溫熱化療協(xié)同處理對胃癌細胞的克隆增殖抑制作用；(2)使用流式細胞儀檢測不同處理組的MGC-803細

6、胞PCNA核蛋白的表達水平；(3)RT-PCR擴增分析不同處理組的MGC-803細胞CyclinEmRNA表達水平；(4)Transwell小室模型測定37℃或43℃，32μg/mlTHP處理60min后的MGC-803細胞侵襲潛能。 第三章吡柔比星與溫熱協(xié)同對胃癌組織的體外作用研究。(1)收集病理學(xué)確診的胃癌手術(shù)切除組織36例，建立人胃癌組織體外立體培養(yǎng)作用模型；(2)分別在37℃和42℃兩種溫度條件下研究THP、DDP、MM

7、C和5FU的抑瘤效果。胃癌組織塊放入預(yù)加培養(yǎng)基培養(yǎng)板中，培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)過夜，第二天加入含有藥物的培養(yǎng)基，42℃處理組42℃培養(yǎng)1h，37℃組則不需要。THP濃度設(shè)定為32μg/ml，DDP處理濃度為50μg/ml，MMC濃度為15μg/ml，氟尿嘧啶為350μg/ml，利用MTS-PMS比色法檢測細胞活性；(3)組織形態(tài)學(xué)HE染色研究評價藥物對胃癌組織的殺傷效應(yīng)。 第四章吡柔比星與溫熱協(xié)同的動物實驗研究。對數(shù)生長期MGC-80

8、3細胞在37℃或43℃，32μg/mlTHP處理60min后注射裸鼠腹腔。記錄腹水出現(xiàn)時間，繪制各處理組存活曲線。計算中位生存時間，分析溫熱及化療藥物處理對裸鼠產(chǎn)生腹水和生存率的影響。 結(jié)果： 第一章吡柔比星與溫熱協(xié)同對胃癌細胞的體外作用研究。THP對MGC-803細胞的殺傷具有較強的溫度依賴關(guān)系，其作用在39-45℃溫度區(qū)間內(nèi)隨溫度升高而加強，在45℃達到最大；THP的殺傷作用具有劑量和時間依賴關(guān)系，隨藥物濃度增加或處

9、理時間的延長，藥物殺傷作用均增強；43℃以上THP32μg/ml和40μg/ml兩濃度組殺傷作用接近并進入平臺期；熱殺傷效應(yīng)在高于43℃時效應(yīng)明顯；在確定溫度條件下，THP對MGC-803細胞的殺傷作用具有時間依賴關(guān)系，隨處理時間的延長，藥物殺傷作用增強；其中，43℃時藥物作用在90min后逐漸進入平臺期；45℃時THP作用60min殺傷作用強于43℃作用90min；THP在確定溫度的各個時點的細胞殺傷作用均強于順鉑；THP和溫熱處理后

10、，細胞生長速度減慢，細胞倍增時間延長(P＜0.01)；MGC-803細胞經(jīng)43℃THP作用10min后，細胞增殖能力下降，未加藥對照組、單純THP組和43℃＋THP組的MGC-803細胞倍增時間從20.4±3.0h減慢至54.3±7.0h和65.5±9.6h；細胞周期研究表明，THP和溫熱協(xié)同處理對處于各細胞周期的細胞均具有良好的殺傷作用，導(dǎo)致處于G2/M期的細胞比例減少，處于S期的細胞比例增多，并出現(xiàn)大量的壞死和調(diào)亡，與加溫或加藥處理

11、組比較均有顯著差異(P＜0.05)，并出現(xiàn)大量的壞死和凋亡；細胞凋亡比例隨溫度升高而增加，THP溫熱協(xié)同處理組為35.6％±3.9，與單純加溫或單純加藥組相比差異顯著(P＜0.01)。 第二章吡柔比星與溫熱協(xié)同對胃癌細胞增殖和侵襲的作用研究。THP與溫熱協(xié)同處理能夠顯著抑制MGC-803細胞的克隆形成能力(P值＜0.01)。37℃對照組集落數(shù)為126±12.2個/孔，43℃處理組為92±10.7個/孔，37℃+THP處理組為36

12、±9.6個/孔，43℃+THP處理組為9.67±4.2個/孔；43℃、37℃+THP和43℃+THP處理組克隆形成抑制率分別為27.0％、71.4％和92.3％；能夠顯著下調(diào)PCNA細胞增殖核蛋白的表達水平和CyclinEmRNA表達水平，從而減少腫瘤復(fù)發(fā)潛能；37℃對照組細胞表達PCNA陽性率和CyclinEmRNA水平分別為93.7±4％、1.243±0.072，43℃處理組為62.3±2.1％、1.256±0.088，37℃+TH

13、P處理組為29.7±1.5％、0.848±0.052，43℃+THP處理組為3±1％、0.056±0.023(P值均＜0.01)；Transwell小室侵襲研究表明，THP與溫熱協(xié)同處理能夠顯著減少侵襲細胞數(shù)量(P值＜0.01)，37℃對照組侵襲細胞數(shù)為92.0±12.1個/視野，43℃處理組為85.7±10.0個/視野，37℃+THP處理組為45.7±8.3個/視野，43℃+THP處理組為10±4個/視野；3個處理組侵襲抑制率分別為6

14、.5％、50.0％和89.1％，統(tǒng)計學(xué)分析表明P均＜0.01，顯著地抑制了MGC-803細胞的侵襲潛能。 第三章吡柔比星與溫熱協(xié)同對胃癌組織的體外作用研究。DDP、MMC和THP對胃癌組織的殺傷均具有較強的溫熱協(xié)同關(guān)系(P=0.000)；其42℃作用均較37℃顯著增強(P＜0.05)；其中THP在37℃和42℃均體現(xiàn)出較強的殺傷效應(yīng)；THP單獨處理和溫熱協(xié)同處理均具有較強的抑制作用，和其它3種藥物抑制率比較具有顯著性差異(P＜0

15、.05)；HE染色表明，藥物和溫熱協(xié)同對腫瘤組織作用均可造成腫瘤細胞變性，壞死，細胞核固縮，并有大量核碎片化現(xiàn)象；THP和溫熱處理后，胃癌組織大部崩解，細胞變性壞死，細胞核固縮，胞漿散失；臨床因素分析表明，THP和溫熱協(xié)同處理效果和胃癌病例的組織分級有關(guān)(P=0.000)，而與年齡、性別、臨床分期、腫瘤大小和術(shù)前癌胚抗原(CEA)水平無關(guān)(P＞0.05)。 第四章吡柔比星與溫熱協(xié)同的動物實驗研究。吡柔比星和溫熱協(xié)同能延遲裸鼠產(chǎn)生

16、腹水的時間，提高裸鼠的生存率。正常37℃培養(yǎng)MGC-803細胞情況下裸鼠腹水平均出現(xiàn)時間為7.2天，43℃處理后裸鼠腹水平均出現(xiàn)時間為9.3天，使用THP處理后裸鼠腹水平均出現(xiàn)時間為21.3天，溫熱協(xié)同組(43℃+THP)的大部分裸鼠在第6周實驗結(jié)束時仍然沒有出現(xiàn)腹水。THP處理組腹水生成時間遠遠長于對照組和單純溫熱組(P=0.00)。經(jīng)THP+43℃處理MGC-803細胞后，MGC-803細胞接種裸鼠，全部裸鼠存活；而單純THP處理后

17、至實驗截止時有3只裸鼠未死亡；中位生存時間為31.0±2.37天；未經(jīng)THP處理過的MGC-803細胞接種裸鼠后，至第6周結(jié)束時裸鼠全部死亡；中午生存時間19.0±1.05天。 結(jié)論：THP對胃癌細胞具有良好的溫熱協(xié)同效應(yīng)和腫瘤殺傷效果。THP與溫熱協(xié)同處理能夠通過顯著下調(diào)胃癌細胞PCNA和CyclinE表達水平，同時抑制其侵襲能力，THP對胃癌組織具有良好的溫熱協(xié)同效應(yīng)和腫瘤殺傷效果，可以減少裸鼠腹水的生成并提高裸鼠的生存率。