1、復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文溶瘤腺病毒介導(dǎo)抑癌基因HCCS1治療腫瘤的實驗研究；抗膜聯(lián)蛋白Ⅰ單克隆抗體的制備與鑒定姓名：蔡幸申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：腫瘤免疫學(xué)指導(dǎo)教師：趙新泰20060401復(fù)日大學(xué)頌十研究生學(xué)位論文第一部分溶瘤腺病毒介導(dǎo)抑癌基因[ICCSl治療腫瘤的實驗研究摘要目的用腫瘤特異性增殖腺病毒ZD55把抑癌基因HCCSl靶向性導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，通過細(xì)胞和動物實驗檢測ZD55聯(lián)合HCCSl對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，探索新的基因病毒治療腫瘤的方

2、法。方法首先將HCCSl基因克隆于質(zhì)粒載體pCAl3中，構(gòu)建亞克隆pCAl3HCCSl，用BglII酶切質(zhì)粒pCAl3HCCSl，切出包含CMV啟動子、HCCSl基因及SV40polyA的HCCSl表達(dá)框。把該表達(dá)框裝入腺病毒穿梭載體pZD55，得到克隆pZD55HCCSl，將其與腺病毒包裝質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，在293細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組，得到基因病毒ZD55一HCCSI。病毒經(jīng)過3次空斑純化，通過PCR、RTPCR和Wes

3、ternblot鑒定病毒的正確性。ZD55一HCCSl在293細(xì)胞中大量擴(kuò)增，并通過CsCl梯度離心純化病毒，測定純化病毒的滴度。用結(jié)晶紫實驗測定病毒對腫瘤細(xì)胞的殺傷性，MTT實驗檢測病毒感染后腫瘤細(xì)胞的存活率，荷瘤動物治療試驗檢測病毒對腫瘤的治療作用。結(jié)果獲得了只能在腫瘤細(xì)胞中增殖復(fù)制、而在正常細(xì)胞中不能復(fù)制，并且在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)HCCSl蛋白的基因病毒ZD55一HCCSl。結(jié)晶紫實驗結(jié)果顯示該病毒具有特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。MT

4、T實驗顯示其對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用明顯強(qiáng)于ONYX015；與ONYX015相似，對正常細(xì)胞沒有殺傷作用。在荷人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620的裸鼠模型中，基因病毒ZD55一HCCSl能顯著抑止腫瘤的生長，甚至可以完全殺滅腫瘤細(xì)胞，抑瘤率達(dá)到97％以上，獲得了很好的治療效果。結(jié)論本研究成功利用缺失E1B一55kDa基因的腺病毒載體攜帶外源治療基因HCCSl，構(gòu)建了一個在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖和表達(dá)HCCSl的腺病毒ZD55HCCSl，并且在細(xì)胞和動物實