1、研究背景及目的:隨著人口老齡化，惡性腫瘤的發(fā)病率隨之升高。乳腺癌曾經是歐美發(fā)達國家女性最常見的惡性腫瘤之一，隨著生活方式的西化，我國乳腺癌的發(fā)病率呈現上升趨勢，這在沿海發(fā)達城市表現尤為明顯。乳腺癌患者的總體預后相對其他惡性腫瘤較好，然而，一旦發(fā)生轉移，5年生存率明顯降低。腫瘤相關巨噬細胞是由單核細胞在腫瘤細胞誘導下分化形成的，通常具有M2型巨噬細胞表型。研究表明，腫瘤相關巨噬細胞浸潤在乳腺癌組織中較為常見，并且其豐度分布與預后不良相關，

2、具體機制不詳。本研究旨在探討腫瘤相關巨噬細胞在乳腺癌干細胞維系及其與乳腺癌轉移的關系，并在此基礎上，進一步研究乳腺癌細胞對單核細胞定向分化的調節(jié)及其干預措施。
　　方法:首先，通過分層隨機化收集復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院2008年1月至2010年5月乳腺癌組織標本120例，采用免疫組化技術分析M2型腫瘤相關巨噬細胞標記CD163在乳腺癌中的表達分布。通過向培養(yǎng)基中加入巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)人為誘導單核細胞株U937分化為M2

3、型巨噬細胞，采用鏡下觀察形態(tài)、RT-PCR及定量RT-PCR鑒定其表型。分別用不同活細胞染料(CMTMR，CMFDA)標記經誘導分化的U937細胞及乳腺癌細胞，利用體外促融合技術(聚乙二醇，PEG1450)輔助他們融合，通過流式細胞儀(FACS)分選融合形成的雜交細胞。通過體內外實驗比較融合細胞與其來源乳腺癌細胞相關生物學行為的差異。其次，通過乳腺癌細胞與U937細胞共培養(yǎng)技術比較不同雌激素受體(ER)狀態(tài)乳腺癌細胞誘導單核細胞分化能力

4、的差異。為此，我們利用慢病毒載體系統(tǒng)藥物篩選了分別帶GFP-PURO和RFP-NEO標記的U937細胞及乳腺癌細胞穩(wěn)定表達株，模擬單核細胞向腫瘤組織浸潤的體內過程，研究不同乳腺癌細胞誘導單核細胞趨化遷移及侵襲能力。采用Bio-Plex multiplex human cytokine試劑盒檢測了不同ER狀態(tài)的乳腺癌細胞株單核細胞分化相關細胞因子(MCP-1，M-CSF, IL6，GM-CSF等)的分泌情況。最后，通過三氧化二砷處理乳腺癌

5、細胞探索其對上述相關細胞因子分泌及乳腺癌細胞成瘤特性的影響。
　　結果:CD163在不同類型乳腺癌組織中的表達存在差異，在ER-乳腺癌標本中表達較ER+高，而且CD163的表達高低是預后不良的獨立因素。經過(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸鹽(PMA)及MCSF的誘導，單核細胞株U937分化成M2型巨噬細胞，表現在形態(tài)及免疫表型上表達CD163、CD204。在PEG的輔助下分化的U937細胞與乳腺癌細胞株MCF7及MDA-MB

6、231存在一定的融合現象，經FACS分選出來的雜交細胞在免疫表型及生物特性上同其來源細胞均有一定差異。表現在雜交細胞具有更高的CD44+CD24-乳腺癌干細胞表型，同時高表達上皮間質轉變(EMT)相關基因。體外實驗表明雜交細胞具有較強的遷移侵襲，而增殖能力較其來源細胞弱。體內實驗研究表明，雜交細胞成瘤能力及轉移能力較強。
　　在乳腺癌細胞與U937細胞共培養(yǎng)誘導后者定向分化的研究中發(fā)現MDA-MB231細胞能在較短時間（一周）內將

7、U937細胞定向分化為具有M2表型的腫瘤相關巨噬細胞，而MCF7細胞不具有短期誘導U937細胞分化的能力。通過定量PCR及Bio-Plex multiplex human cytokine試劑盒檢測發(fā)現MDA-MB231與MCF7在誘導單核細胞分化的相關細胞因子（M-CSF, IL6等）的表達上存在明顯差異，這一結果與其在誘導U937細胞分化的功能上完全吻合。
　　三氧化二砷(As2O3)是一種礦物類中藥，在抗腫瘤的研究中發(fā)現其具

8、有誘導急性早幼粒細胞白血病(APL)分化的作用。體外實驗結果證實亞致死劑量的As2O3能夠抑制MDA-MB231細胞分泌促單核細胞定向分化的細胞因子M-CSF及IL6。在MDA-MB231細胞形成的移植瘤小鼠模型中發(fā)現As2O3能夠降低成瘤小鼠外周血中相關細胞因子水平，使瘤體壞死及癌細胞ER狀態(tài)轉換。
　　結論:M2巨噬細胞能夠通過與乳腺癌細胞融合形成雜交細胞而促進乳腺癌轉移;形成的雜交細胞具有部分乳腺癌干細胞的特性;不同ER狀態(tài)