1、【目的】細胞凋亡（apoptosis）是哺乳動物細胞生產(chǎn)抗體藥物過程中限制活細胞密度提高的關(guān)鍵因素之一，進而制約了抗體藥物的產(chǎn)量。本課題采用基因工程手段在無血清懸浮培養(yǎng)的中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary, CHO）中過表達一種新型凋亡調(diào)控基因TIGAR（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator），分析該CHO-TIGAR細胞株在批次培養(yǎng)中的生長代謝、抑制凋

2、亡等現(xiàn)象，探究TIGAR基因在CHO細胞中抑制凋亡的主要機制，進而闡述該研究相關(guān)應用價值及意義。
　　【方法】第一部分構(gòu)建過表達人TIGAR的CHO細胞株的主要方法有：①設計特異性引物通過PCR擴增得到hTIGAR基因，構(gòu)建pcDNA3.0-TIGAR真核表達載體后轉(zhuǎn)染CHO-SP細胞并挑選陽性克隆，同時以轉(zhuǎn)染pcDNA3.0空載體的細胞作為陰性對照。利用Real-time PCR檢測TIGAR基因mRNA水平表達。②在500 m

3、L搖瓶中進行批次培養(yǎng)，獲取CHO-TIGAR細胞株和對照細胞CHO-pcDNA3.0的生長曲線、活率、葡萄糖消耗量等參數(shù)。
　　本課題的第二部分著重探討TIGAR基因在CHO細胞中抑制凋亡的主要機制，其主要方法有：①批次培養(yǎng)中通過Annexin V/PI法檢測CHO-TIGAR細胞和對照組在第4-7天的凋亡率；利用DCFH-DA染料檢測實驗組與對照組在批次培養(yǎng)中每天的活性氧族（reactive oxygen species, RO

4、S）水平。②Western blot法檢測CHO-TIGAR細胞和 CHO-pcDNA3.0細胞在批次培養(yǎng)第5-8天中 Caspase-9、Caspase-3、Caspase-7等的表達情況，比較兩株細胞的凋亡信號通路中關(guān)鍵分子的差異。
　　【結(jié)果】在批次培養(yǎng)中，CHO-TIGAR細胞株的最高細胞密度出現(xiàn)在第四天，達到7.2×106 cells/mL，對照組的最高密度出現(xiàn)在同一時間，只有6.5×106 cells/mL；細胞活率、

5、培養(yǎng)天數(shù)方面，CHO-TIGAR細胞均優(yōu)于對照細胞株；通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，實驗組細胞在批次培養(yǎng)的第6、7、8天凋亡率分別為5.5%、6.08%和21.92%，在對照組中相對應的為10.4%、20.28%、50.3%；檢測批次培養(yǎng)1-5天細胞內(nèi)ROS水平，CHO-TIGAR細胞均低于對照組；Western blot實驗證實對照組中與凋亡發(fā)生相關(guān)的蛋白質(zhì)Caspase-9、Caspase-3/7表達水平均高于CHO-TIGAR細胞