1、目的:研究單核細(xì)胞和肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的HA分布、HA受體CD44和ICAM-1的表達(dá)以及HA及其受體對(duì)單核細(xì)胞粘附和遷移的作用.材料和方法用Percoll非連續(xù)密度梯度兩次離心法分離狗靜脈血單核細(xì)胞,用兩次植塊法分離狗PMVECs.通過親和熒光染色標(biāo)記單核細(xì)胞以及PMVECs的HA,用免疫熒光染色法標(biāo)記單核細(xì)胞和PMVECs的CD44以及單核細(xì)胞的ICAM-1.經(jīng)HAase消化單核細(xì)胞表面的HA后,觀察單核細(xì)胞的粘附.通過在培養(yǎng)皿底面涂

2、布HA和在培養(yǎng)液中添加HA,比較單核細(xì)胞的粘附.用抗體阻斷單核細(xì)胞的CD44和ICAM-1后,比較粘附的單核細(xì)胞數(shù)目.在單核細(xì)胞與PMVECs共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),消化單核細(xì)胞表面的HA和阻斷單核細(xì)胞的CD44后,觀察單核細(xì)胞在內(nèi)皮單層上的粘附,并在掃描電鏡下觀察單核細(xì)胞粘附于內(nèi)皮單層后的形態(tài)學(xué)特征.通過用HAase消化掉單核細(xì)胞表面的HA、在細(xì)胞培養(yǎng)池膜上涂布HA和在培養(yǎng)液中添加HA,計(jì)數(shù)跨膜遷移的單核細(xì)胞.阻斷單核細(xì)胞的CD44和ICAM-1

3、后,觀察單核細(xì)胞跨膜遷移的變化.結(jié)果:經(jīng)Percoll非連續(xù)密度梯度兩次離心法分離的單核細(xì)胞以及經(jīng)兩次植塊法分離的PMVECs,純度為95﹪以上.該實(shí)驗(yàn)分離的單核細(xì)胞和PMVECs具有較高的活性.單核細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)存在HA,表達(dá)CD44和ICAM-1.PMVECs表面有HA,表達(dá)CD44.用HAase消化掉單核細(xì)胞表面HA后,粘附于培養(yǎng)皿底的單核細(xì)胞減少,粘附于內(nèi)皮單層上的單核細(xì)胞無明顯變化.在培養(yǎng)皿底面涂布HA后,粘附的單核細(xì)胞增多

4、.在培養(yǎng)液中加入HA后,粘附的細(xì)胞減少.阻斷單核細(xì)胞的CD44后粘附于HA底物和內(nèi)皮單層上的單核細(xì)胞減少.阻斷ICAM-1后粘附于HA底物的細(xì)胞數(shù)無明顯變化.消化單核細(xì)胞表面的HA后,跨膜遷移的單核細(xì)胞減少.在細(xì)胞培養(yǎng)池的膜上面涂布HA后,跨膜遷移的單核細(xì)胞增多.培養(yǎng)液中添加HA后,跨膜遷移的單核細(xì)胞減少.阻斷單核細(xì)胞的CD44后,跨膜遷移的細(xì)胞減少.阻斷ICAM-1后跨膜遷移的細(xì)胞數(shù)無明顯變化.結(jié)論:單核細(xì)胞Percoll非連續(xù)密度梯

5、度兩次離心法和PMVECs兩次植塊法具有方法簡(jiǎn)便、分離細(xì)胞的純度和活性高等優(yōu)點(diǎn).單核細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)分布有HA,在細(xì)胞表面表達(dá)CD44和ICAM-1.PMVECs表面存在HA,表達(dá)CD44.單核細(xì)胞表面HA和底物HA促進(jìn)單核細(xì)胞的粘附,但游離HA阻礙單核細(xì)胞的粘附.CD44對(duì)于單核細(xì)胞粘附于HA底物和肺微血管內(nèi)皮具有介導(dǎo)作用.單核細(xì)胞表面HA和底物HA促進(jìn)單核細(xì)胞的遷移,但游離HA阻礙單核細(xì)胞的遷移.CD44介導(dǎo)底物HA對(duì)單核細(xì)胞遷移的