1、本文根據(jù)survivin基因高表達(dá)于各類型淋巴瘤組織和淋巴瘤/白血病細(xì)胞株的特性，采用化學(xué)合成siRNA(smallinterferenceRNA)法和短發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA，shRNA)載體表達(dá)技術(shù)，構(gòu)建了pSilencerTM4.1neo-CMV-Survivin-shRNA重組質(zhì)粒并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至多株人淋巴瘤/白血病細(xì)胞系，觀察Survivin表達(dá)沉默對(duì)淋巴瘤/白血病細(xì)胞包括細(xì)胞凋亡、增殖和化療藥物藥敏性等

2、在內(nèi)生物學(xué)特性的影響，初步探討Survivin基因在淋巴瘤/白血病作用機(jī)制及其在腫瘤基因靶向治療中的意義。 一RNA干擾應(yīng)用于淋巴瘤/白血病腫瘤基因研究的靶基因篩選 目的免疫組織芯片檢測(cè)抗凋亡基因腫瘤凋亡相關(guān)基因等在淋巴瘤/白血病組織中表達(dá)情況，探討它們與淋巴瘤/白血病的相關(guān)性，擬篩選出RNA干擾最適合的靶基因。 方法收集190例石蠟包埋非霍奇金淋巴瘤(NHL)組織，10例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織、淋巴瘤/白血病細(xì)胞

3、系Jurkat、Raji、Daudi，采用免疫組化SP方法和RT-PCR方法檢測(cè)抗凋亡基因Survivin、BCL-2、Bcl-xl、P53、P73、P63、mdm2、P21等在淋巴瘤組織和淋巴瘤/白血病細(xì)胞系的表達(dá)情況。 結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，上述抗凋亡基因中Survivin在190NHL組織陽性表達(dá)率最高，為77.36％(148/190)，Survivin表達(dá)與B-NHL侵襲性正相關(guān)；在高度惡性造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞系Jurkat

4、、Raji、Daudi細(xì)胞中呈強(qiáng)陽性表達(dá)；在正常人外周血淋巴細(xì)胞不表達(dá)。 結(jié)論Survivin在NHL高表達(dá)，提示干擾其表達(dá)可產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞生物學(xué)特性改變，是RNA干擾用于淋巴瘤/白血病腫瘤基因研究的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。 二RNA干擾Survivin基因在淋巴瘤/白血病細(xì)胞中的表達(dá) 目的通過shRNA載體表達(dá)技術(shù)，構(gòu)建了pSilencerTM4.1neo-CMV-Survivin-shRNA重組質(zhì)粒，建立瞬時(shí)和穩(wěn)定表達(dá)

5、Survivin-shRNA的淋巴瘤/白血病細(xì)胞系。 方法和結(jié)果1構(gòu)建重組shRNA表達(dá)載體從大腸桿菌DH5α提取表達(dá)載體pSilencer4.1-CMVneoDNA。 2成功篩選出了攜帶G418抗性重組pSurvivin-shRNA表達(dá)載體的Jurkat、Raji、Daudi細(xì)胞株。 3瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Jurkat、Raji、Daudi細(xì)胞SurvivinmRNA和蛋白表達(dá)水平相對(duì)于PBS處理組和pControl

6、-shRNA處理組均有明顯下降，表達(dá)抑制率為60-70％。 結(jié)論RNA干擾技術(shù)是一種快速、簡便、高效的基因沉默工具。 三RNA干擾survivin表達(dá)對(duì)淋巴瘤/白血病細(xì)胞生物學(xué)特性影響目的探討RNA干擾使Survivin表達(dá)下調(diào)后對(duì)淋巴瘤/白血病Jurkat、Raji、Daudi細(xì)胞系包括細(xì)胞凋亡、增殖在內(nèi)等細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。 方法和結(jié)果1RNA干擾survivin表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡水平的影響流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，

7、與Control-shRNA和PBS處理組相比，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡鋒；轉(zhuǎn)染組細(xì)胞與兩對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異(P＜0.05)；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組凋亡指數(shù)(apoptosisindex，AI)與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組之間AI比較統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差異。 2RNA干擾survivin表達(dá)對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系生長增殖狀態(tài)的影響生長曲線顯示，與Control-shRNA和PBS處理組細(xì)胞相比，Survivin-shRNA穩(wěn)定

8、轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的生長曲線明顯壓低，細(xì)胞生長趨勢(shì)顯著減慢。 3RNA干擾survivin表達(dá)對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞倍增時(shí)間的影響與PBS和Control-shRNA處理組兩對(duì)照組相較，各株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Survivin-shRNA細(xì)胞的倍增時(shí)間明顯延長，分別為Jurkat：55.41±3.74h，Raji：60.75±2.38h，Daudi：58.16±1.96h，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性(*P＜0.05)結(jié)論RNA干擾survivin表達(dá)能有效地抑

9、制瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞SurvivinmRNA和蛋白水平的表達(dá)、顯著增加細(xì)胞凋亡率(AI)，細(xì)胞生長趨勢(shì)明顯放慢、細(xì)胞倍增時(shí)間延長；結(jié)果提示Survivin的異常表達(dá)與淋巴瘤/白血病細(xì)胞增殖、抗凋亡活性密切相關(guān)，Survivin直接負(fù)性調(diào)控淋巴瘤/白血病細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)細(xì)胞增殖，表明Survivin有可能成為一個(gè)具有潛在應(yīng)用價(jià)值的淋巴瘤/白血病腫基因治療靶點(diǎn)。 四RNA干擾Survivin表達(dá)對(duì)淋巴瘤/白血病細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響

10、目的通過已建立的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Survivin-shRNA淋巴瘤/白血病細(xì)胞系，研究RNA干擾Survivin對(duì)淋巴瘤/白血病細(xì)胞多個(gè)相關(guān)基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討Survivin在淋巴瘤/白血病細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展中與相關(guān)基因相互作用的分子機(jī)制。 方法和結(jié)果Westernblot檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞Survivin表達(dá)下調(diào)后對(duì)多個(gè)與Survivin相關(guān)基因包括P53，Bcl-2，Bcl-xl，Caspase-3，Caspase-9蛋白表達(dá)水平

11、的影響。結(jié)果顯示，與Control-shRNA處理組和PBS處理組比較，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Bcl-2、Bcl-xl蛋白表達(dá)量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差異；Caspase-3、Caspase-9和p53蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，上調(diào)率分別為58.49％、40.25％和38.67％，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性(P＜0.05)。 結(jié)論1實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，癌基因Survivin可能通過直接抑制caspase-3、caspase-9等活性阻遏多個(gè)凋亡信號(hào)通路誘導(dǎo)

12、的細(xì)胞凋亡。 2.RNA干擾抑制Survivin表達(dá)后野生型P53基因的表達(dá)有所增加，提示了淋巴瘤/白血病細(xì)胞存在P53突變可能使野生型P53對(duì)抗凋亡基因Survivin的負(fù)性調(diào)控功能下降或喪失，導(dǎo)致Survivin過度表達(dá)；而Survivin過表達(dá)又可能對(duì)野生型P53起到一定程度負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步抑制野生型P53發(fā)揮其正常功能。 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Survivin基因與BCL-2基因家族可能是分別通過不同的信號(hào)傳導(dǎo)

13、通路負(fù)性調(diào)控細(xì)胞凋亡的，它們之間可能不存在直接的相互作用。 五RNA干擾Survivin表達(dá)對(duì)淋巴瘤/白血病細(xì)胞抗腫瘤藥物敏感性的影響 目的觀察RNA干擾淋巴瘤/白血病細(xì)胞株Survivin表達(dá)后腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的影響，探討腫瘤基因靶向治療與化療藥物聯(lián)合治療的效果。 方法與結(jié)果1MTT檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Survivin-shRNA前后Daudi細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性相同劑量的抗腫瘤藥物阿霉素(ADM)、4-羥基

14、-環(huán)磷酰氨(CTX)、長春新堿(VCR)、甲氨蝶呤(MTX)對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Survivin-shRNADaudi細(xì)胞的生長抑制率明顯大于PBS和Control-shRNA處理組，表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Daudi細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性較轉(zhuǎn)染前(PBS處理組)和轉(zhuǎn)染無功能shRNA(Control-shRNA)對(duì)照組顯著提高。 2不同濃度阿霉素(ADM)對(duì)Survivin-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染前后Daudi細(xì)胞Survivin表達(dá)水平的影響

15、 三個(gè)藥物濃度0ug/ml，0.50ug/ml，5.0ug/mlADM作用于PBS處理組、Control-shRNA處理組和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Survivin-skRNA細(xì)胞48h，Westernblot方法檢測(cè)三組細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，低濃度(0.50ug/ml)和高濃度(5.0ug/ml)ADM處理48h后PBS處理組、Control-shRNA處理組和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞Survivin的蛋白表達(dá)水平較未經(jīng)ADM處理組均有下調(diào)

16、；高濃度ADM較低濃度ADM處理組Survivin蛋白表達(dá)水平的下調(diào)更為明顯，其中高濃度5.0ug/mlADM作用48h后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的Survivin蛋白表達(dá)水平幾乎完全抑制。 3不同濃度阿霉素(ADM)對(duì)Survivin-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染前后Daudi細(xì)胞的凋亡水平的影響： 選用0ug/ml，0.50ug/ml，5.0ug/mlADM分別作用于PBS處理組、Control-shRNA處理組和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Survivin

17、-shRNA的Daudi細(xì)胞，48h后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)三組細(xì)胞的凋亡水平。FCM結(jié)果顯示，低濃度(0.50ug/ml)和高濃度(5.0ug/ml)ADM作用48h后三組細(xì)胞凋亡水平較未經(jīng)ADM(0ug/ml)作用組均有上調(diào)，其中，ADM與Survivin-shRNA聯(lián)合作用組細(xì)胞的凋亡水平較PBS處理組、Control-shRNA處理組有顯著提高；高濃度(5.0ug/ml)ADM與Survivin-shRNA聯(lián)合作用組細(xì)胞的凋亡水平更

18、高，達(dá)89.70±4.71％。 結(jié)論1.Survivin-shRNA能增加Daudi細(xì)胞對(duì)常用抗腫瘤藥物ADM、CYX、MTX、VCR的敏感性，明顯增強(qiáng)抗腫瘤藥物對(duì)細(xì)胞的殺傷作用。 2.ADM可能通過抑制抗凋亡基因Survivin在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)而起抗腫瘤效應(yīng)的。3.RNA干擾與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用的抗腫瘤效應(yīng)較兩者單獨(dú)使用的效果更為明顯，提示RNA干擾基因靶向治療與常規(guī)化療手段相結(jié)合很有可能成為將來抗腫瘤治療的一個(gè)新策略。