1、鵝細小病毒（Goose parvovirus,GPV）屬于細小病毒科成員之一，能夠引起雛鵝和雛番鴨發(fā)病，并以小腸粘膜表層壞死脫落能形成小腸栓塞為主要特征。自2015年以來，國內(nèi)不斷有報道稱櫻桃谷鴨、北京鴨爆發(fā)了一種以短喙長舌為特征性癥狀的疾病（Duck Beak Atrophy and Dyndrome Syndrome,BADS）。經(jīng)Chen等人的分離鑒定，確定為新的鴨源鵝細小病毒（Novel Goose Parvovirus,NGP

2、V），本研究的目的是建立檢測新型鴨源鵝細小病毒（NGPV）的半套式PCR方法，用該方法對山東、江蘇兩地進行了NGPV的流行情況調(diào)查的，并對分離的其中2株NGPV進行全基因組測序及同源性和進化樹的分析。
　　1.山東、江蘇兩地送檢病料的初步檢測
　　根據(jù)GeneBank已公布的GPV數(shù)據(jù)，用DNASTAR.Lasergene.v7.1軟件設(shè)計了GPV的PCR檢測引物。對山東、江蘇兩地8個發(fā)病鴨群120只發(fā)病鴨分別提取心、肝、脾

3、、肺、腎、胸腺、法氏囊、胰腺、腦、膽汁10個臟器組織DNA，共計1200個樣進行初步的PCR檢測，對引物的特異性進行分析，并統(tǒng)計每個鴨群及各個內(nèi)臟的檢出率。結(jié)果顯示用該方法檢測，每個群的最高檢出率為86.7％，最低檢出率為66.7%，平均檢出率為75.8%,除了腦沒檢出病毒核酸外，其他臟器中病毒核酸檢出率最高為肝臟（62.6%），最低為肺臟（9.9%），平均檢出率為34.5%。
　　2.檢測新型鴨源鵝細小病毒半套式PCR方法的建立

4、與應(yīng)用
　　根據(jù)GeneBank已公布的12株GPV、2株 NGPV的序列比對結(jié)果，用DNASTAR.Lasergene.v7.1軟件在檢測設(shè)計引物的基礎(chǔ)上設(shè)計了檢測NGPV的半套式PCR外側(cè)引物。GPV-A-F和GPV-A-R能擴增出NGPV長度為779bp的目的基因,同時NGPV-B-R與GPV-A-F組合能夠擴出NGPV長度為148bp的目的基因，而擴不出小鵝瘟疫苗的目的基因。最佳條件探索結(jié)果：當(dāng)退火溫度為58℃，Mg2+濃

5、度為1.5mM（1.5μL），模板加1μL，引物各加1μL（1pM），31個循環(huán)時，效率最高。用建立的半套式PCR方法對病料檢測，特異性很好，對1型鴨圓環(huán)（DuCV-1）、2型鴨圓環(huán)病毒（DuCV-2）、鴨瘟病毒(DVE)、大腸桿菌（E.coli）、沙門氏菌（SE）、鴨疫里默氏桿菌（Ra）5種常見鴨病顯示陰性，靈敏性好，最低可以檢出100拷貝NGPV病毒核酸。
　　應(yīng)用建立的半套式PCR方法對前面普通PCR檢測的樣品進行復(fù)檢，統(tǒng)計

6、每個鴨群和10個內(nèi)臟共計1200個樣的檢出率，并與普通PCR方法獲得的數(shù)據(jù)進行比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用建立的半套式PCR檢測，對鵝細小檢測陽性的病料進行檢測，每個鴨群的最高檢出率為93.3%，最低為73.3%，平均為80.8%,除了腦沒檢出病毒外，其他臟器的檢出率最高為肝臟（93.8%），最低檢出率為肺臟（23.7%），平均檢出率為55.8%，與普通PCR相比明顯提高了檢出率。流行情況調(diào)查表明，山東、江蘇2個地方的NGPV感染情況比較嚴重，

7、應(yīng)該引起重視。
　　3.SD-01株和SD-02株NGPV的全基因組測序及系統(tǒng)進化分析
　　根據(jù)GeneBank已公布的12株GPV和2株NGPV序列，用DNASTAR.Lasergene.v7.1軟件設(shè)計了5對擴增NGPV的全基因組序列的引物，對分離的NGPV SD-01和SD-02毒株進行分段擴增并測序，拼接后獲得2株NGPV的全基因組序列，并與其他GPV和NGPV全基因組序列進行同源性分析和進化樹構(gòu)建。SD-01和SD

8、-02的全基因組與其他的12株GPV同源性在92.2～97.0%，而與sdlc01和QH15的同源性99.1～99.6%之間，與MDPV-FM的同源性分別為80.9%和81.1%,進化樹分析發(fā)現(xiàn)2株NGPV屬于GPV這一大分支，與 sdlc01株和QH15株在同一個小的分支上；對SD-01和SD-02的VP3基因與12株GPV的同源性分析，發(fā)現(xiàn)VP3與GDaGPV的同源性最低為93.0%，與82-032v最高為98.3%，SD-01與

9、sdlc01株和QH15株同源性均為99.8%，而與FM株的同源性僅為81.5%；對SD-01和SD-02的VP3編碼的氨基酸同源性分析，與FM株的同源性最低分別為91.0%和90.8%，與GDaGPV同源性最低分別為96.6%和96.4%，SD-01與B株、VG321株的同源性最高，均為98.7%，SD-01與NGPV的sdlc01株和QH15株相比同源性分別為100%和99.6%，SD-02和sdlc01和QH15相比分別為99.8