1、TNF α是炎癥反應(yīng)的一種主要介質(zhì),在許多疾病的病理過(guò)程中起著重要作用,抗TNF α抗體對(duì)這些病理過(guò)程能起拮抗作用,從而產(chǎn)生治療效果.在早期工作中,我們?cè)鴱囊恢陠慰寺】贵w雜交瘤克隆出抗TNF α抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因并在大腸桿菌表達(dá)了其單鏈抗體(ScFv)和Fab抗體.為進(jìn)一步提高其親和力,該研究嘗試多種突變方法,利用抗體庫(kù)技術(shù),建立體外抗體親和力成熟流程,此流程將適用于其它工程抗體.第一部份:隨機(jī)突變提高噬菌體單鏈抗體的親和力.首先

2、對(duì)pscTNF單鏈抗體基因進(jìn)行兩輪錯(cuò)配PCR,構(gòu)建突變庫(kù),庫(kù)容為7×10<'6>.部份克隆測(cè)序顯示堿基突變率為3.7﹪,氨基酸突變率為10.6﹪.這些突變有37﹪分布于CDR區(qū),63﹪分布于骨架區(qū).對(duì)此庫(kù)進(jìn)行四輪淘篩,獲得了多株特異性結(jié)合克隆,有些結(jié)合能力有所提高,但親和力改善不明顯.為觀察這些突變點(diǎn)重組后能否進(jìn)一步提高親和力,我們嘗試了2種技術(shù)路線(xiàn)進(jìn)行基因重組.第二部份:CDR3突變提高噬菌體抗體親和力.我們嘗試了CDR3部位的限定性

3、突變,選擇Fab噬菌體抗體,采用了兩種策略,一種是在合成引物時(shí)控制每個(gè)位置不同堿基的摻入比率,使親本殘基出現(xiàn)的幾率約為70﹪;另一種是對(duì)選定的殘基按codon-based突變合成引物,使每個(gè)殘基位置有50﹪的隨機(jī)突變,其中重鏈CDR3較長(zhǎng),前后各5個(gè)殘基分別突變,通過(guò)重疊延伸PCR的方法分別構(gòu)建輕、重鏈共6個(gè)突變庫(kù).通過(guò)四輪淘篩,經(jīng)測(cè)序和非競(jìng)爭(zhēng)性酶免分析法測(cè)定親合常數(shù),從輕鏈突變庫(kù)中篩出一株(K8)變種,其親和力提高近28倍.從重鏈突變

4、庫(kù)中挑出10株序列不同的特異性克隆,親和力提高近2-65倍.然后將突變的輕鏈基因與突變的重鏈基因組合,以及重鏈CDR3區(qū)前后不同的突變點(diǎn)之間組合,經(jīng)篩選后獲得親和力進(jìn)一步提高的克隆.該實(shí)驗(yàn)共嘗試比較了5種突變方法.從錯(cuò)配PCR庫(kù)中沒(méi)有獲得親和力有明顯改善的抗體,在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過(guò)DNA交換和交替延伸PCR使親和力有了較明顯提高.對(duì)CDR3的突變均得到了親和力提高的克隆,其中CDR3熱點(diǎn)突變只獲得一株親和力有顯著提高的變種,對(duì)輕重鏈CD