1、microRNAs(miRNA)是一類長約22核苷酸的非編碼的單鏈RNA分子。它們參與細(xì)胞中各種基本生命過程的調(diào)控，包括發(fā)育、凋亡和細(xì)胞增殖，甚至是癌癥發(fā)生。miRNA可以直接導(dǎo)致mRNA的降解或在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控mRNA的翻譯。miRNA let-7a-1的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。近來研究發(fā)現(xiàn)，miRNAlet-7a-1在前列腺癌細(xì)胞中異常低表達(dá)，異源高表達(dá)miRNA let-7a-1能夠有效地調(diào)控IGF-1R介導(dǎo)的信號通路，抑制

2、前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。
　　 本研究開展了miRNA let-7a-1影響前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制研究。(1)首先構(gòu)建miRNA let-7a-1真核表達(dá)載體pSilencer-let-7a-1，轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞PC-3細(xì)胞，利用RT-PCR檢測該表達(dá)載體的表達(dá)效率。(2)構(gòu)建miRNAlet-7a-1靶序列-報(bào)道基因融合質(zhì)粒pMIR-Report-let-7a-1T，熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測了

3、pre-let-7a-1的表達(dá)及其成熟miRNA let-7a-1的作用，采用MTT比色法、流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst33258細(xì)胞染色檢測了miRNA let-7a-1對前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖和凋亡的影響，進(jìn)一步確定miRNA let-7a-1的表達(dá)及其生物學(xué)活性。(3)pSilencer-let-7a-1轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞PC-3細(xì)胞，利用RT-PCR和Western blotting分別檢測了miRNA let-7a-1過表達(dá)對靶

4、基因IGF-1R和Bcl2 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。(4)構(gòu)建了IGF-1R-3UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，將熒光素酶報(bào)道基因質(zhì)粒與pSilencer-let-7a-l真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞，熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測miRNA let-7a-1與靶基因3UTR結(jié)合位點(diǎn)的作用。(5)IGF-1處理PC-3細(xì)胞后，MTT比色法進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA let-7a-1過表達(dá)下調(diào)IGF-1R，阻斷IGF-1R信號通路，抑制前列腺癌PC

5、-3細(xì)胞的增殖。(6)構(gòu)建了ELK-1熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(pGL4-ELK-1)，與pSilencer-let-7a-1真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞，IGF-l處理后，熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測miRNA let-7a-1過表達(dá)對IGF-1R細(xì)胞增殖信號通路的影響，RT-PCR和Western blotting分別檢測了miRNAlet-7a-1過表達(dá)對IGF-1R信號通路靶基因c-fos表達(dá)的影響。(7)RT-PCR檢測miRNAl

6、et-7a-1過表達(dá)對增殖凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：(1)成功構(gòu)建了miRNA let-7a-1真核表達(dá)載體pSilencer-let-7a-1，瞬時轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后能有效表達(dá)。MTT比色法和流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)了miRNA let-7a-1能抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。(2)成功構(gòu)建了pMIR-Report-let-7a-1T報(bào)告基因融合質(zhì)粒，經(jīng)DNA測序正確。(3)RT-PCR和Western blot

7、ting結(jié)果表明，miRNAlet-7a-1過表達(dá)有效抑制靶基因IGF-1R mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)。(4)成功構(gòu)建了IGF-1R-3UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，與pSilencer-let-7a-1真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞，熒光素酶報(bào)告基因活性明顯降低，表明miRNA let-7a-1過表達(dá)可直接作用于IGF-1R-3UTR的靶序列，下調(diào)靶基因IGF-1R的表達(dá)。(5)IGF-1處理PC-3細(xì)胞后，MTT比色法結(jié)果顯示miRNA

8、 let-7a-l能有效抑制IGF-1對前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖的刺激作用；ELK-1熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示，miRNAlet-7a-1可抑制IGF-1R細(xì)胞增殖信號通路；RT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示，miRNA let-7a-1可使IGF-1R信號通路靶基因c-fos mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平下降。(6)RT-PCR結(jié)果顯示，miRNA let-7a-1下調(diào)Cyclin-E、Cyclin-D、CDK6的

9、mRNA的表達(dá)，上調(diào)P27mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)論：本研究結(jié)果表明，miRNA let-7a-1可直接作用于靶基因IGF-1R的3UTR靶序列，下調(diào)IGF-1R的表達(dá)，從而抑制IGF-1R信號通路對前列腺癌細(xì)胞的促增殖抗凋亡作用。另外，miRNA let-7a-1還可間接作用于細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子Cylin-E、Cyclin-D、CDK6和P27的表達(dá)，影響前列腺癌細(xì)胞的增殖。這一研究結(jié)果為深入研究miRNA let-7a-1在