1、粘蟲Mythimna separata(Walker)隸屬鱗翅目夜蛾科，是一種典型的季節(jié)性遠距離遷飛害蟲，也是嚴重威脅我國糧食作物生產(chǎn)安全的重大害蟲，廣泛分布于亞洲和澳洲的多個國家和地區(qū)。粘蟲在我國每年南北往返遷飛危害。近年來，由于農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)變化，粘蟲的發(fā)生危害呈現(xiàn)加重趨勢，尤其是2012和2013年在全國范圍暴發(fā)成災，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴重的影響。生物鐘基因是調控生物節(jié)律的一類基因，在細胞、組織、器官和行為等各層次中起作用。而粘蟲作為

2、一種晝伏夜出性害蟲，其飛行、交配、產(chǎn)卵等行為均發(fā)生于夜晚，具有明顯的晝夜節(jié)律。但截至目前，有關其晝夜活動節(jié)律的分子調控機制尚未見報道。
　　本研究首次對粘蟲4個生物鐘基因進行了克隆，在此基礎上，通過實時熒光定量PCR技術分析了相應的表達模式，并就生物鐘基因對粘蟲活動節(jié)律的調控進行了進一步研究。取得如下主要研究結果。
　　1.根據(jù)粘蟲轉錄組數(shù)據(jù)庫擴增獲得4種粘蟲生物鐘基因period、timless、clock和cycle，分

3、別命名為Msper(KY446805)、Mstim(KY446806)、Msclk(KY446807)、Mscyc(KY825136)，長度分別為3579 bp、3132 bp、1851 bp、2094 bp，分別編碼1192、1043、616、697個氨基酸，預測蛋白分子量分別為132 kDa、117kDa、69 kDa、75 kDa，理論等電點分別為6.50、5.14、5.63、6.74。經(jīng)序列比對，MsPER與一點粘蟲Mythim

4、naunipuncta、甜菜夜蛾Spodoptera exigua、芹菜夜蛾Anagrapha falcifera等夜蛾科昆蟲PER序列一致性達83％以上;MsTIM與棉鈴蟲Helicoverpa armigera、甜菜夜蛾、蛀莖夜蛾Sesamia nonagrioides等昆蟲TIM序列一致性達80％以上;MsCLK與甜菜夜蛾、棉鈴蟲CLK序列一致性達90％以上;MsCYC與蛀莖夜蛾，家蠶Bombyx mori、小菜蛾plutella

5、xylostella、柞蠶Antheraea pernyi等CYC序列一致性達68％以上。進化樹分析結果與氨基酸序列比對結果基本一致。
　　2.采用實時熒光定量PCR技術分析了粘蟲生物鐘基因Msper、Mstim、Mscyc和Msclk的時空表達模式:
　　(1)4個生物鐘基因的mRNA在粘蟲不同發(fā)育時期的表達量差異顯著，成蟲期表達量顯著高于其他發(fā)育階段。除Mscyc基因在1齡幼蟲期表達量高于卵期外，其他基因均為幼蟲期表達量

6、最低。
　　(2)成蟲不同組織生物鐘基因的表達量不同。Msper、Mstim、Mscyc在觸角中表達量最高，其次為頭部，而Msclk在頭部的表達量顯著高于觸角。在飛行肌、足及生殖腺中，上述4種基因的表達量無明顯的規(guī)律性。
　　(3)4個生物鐘基因的相對表達量均具有晝夜節(jié)律變化，其中Msper、Mstim與Msclk在雌、雄成蟲中均表現(xiàn)為光期表達量較低，暗期表達量較高;而Mscyc在光期起始時表達量最高，暗期末表達量最低。

7、r>　　3.采用顯微注射法對Msper基因進行干擾，并測定其活動節(jié)律變化。結果表明干擾24 h后Msper表達量下降60％，受干擾后粘蟲在夜晚無高飛行強度;而對照試蟲在暗期末期出現(xiàn)一個高飛行強度。且受干擾的個體在沉默試劑生效的48 h內無產(chǎn)卵現(xiàn)象，試劑失效后產(chǎn)卵行為恢復。
　　本研究首次克隆得到4個粘蟲生物鐘基因，并明確了Msper、Mstim、Mscyc和Msclk在粘蟲不同發(fā)育時期、成蟲不同組織中的晝夜表達規(guī)律，且證明Mspe