1、二斑葉螨Tetranychus urticae(Koch)和朱砂葉螨T.cinnabarinus(Boisduval)同屬蛛形綱Arachnida、蜱螨亞綱Acari、真螨目Acariformes、葉螨科Tetranychidae、葉螨屬Tetranychus，廣泛分布于世界各地，它們不但危害果樹，還危害各類經(jīng)濟(jì)作物、林木、溫室栽培植物和觀賞植物等，是農(nóng)林生產(chǎn)中重要的害螨種類。前者自Akl983年進(jìn)入中國(guó)后，目前分布于中國(guó)東北、華北、西

2、北及蘇皖兩省北部，危害多種果樹及經(jīng)濟(jì)植物，在山東、遼寧、陜西等省已上升成為果樹的第一大害螨，嚴(yán)重威脅果樹業(yè)生產(chǎn)；后者是我國(guó)分布最廣、發(fā)生最嚴(yán)重的一種農(nóng)業(yè)害螨，在各地嚴(yán)重危害棉花、豆類、桑、木薯、木瓜、瓜類以及林木、溫室栽培植物和多種觀賞植物，對(duì)寄主植物產(chǎn)生機(jī)械傷害和毒害作用，引起植物減產(chǎn)和品質(zhì)下降。由于二者擴(kuò)散迅速、世代周期短、發(fā)育進(jìn)度快、繁殖能力強(qiáng)，所以極易在新的環(huán)境定殖，形成新的地理種群。本文采用DNA序列分析法，分別對(duì)采自中國(guó)不同

3、地區(qū)的二斑葉螨與朱砂葉螨的線粒體DNA COl基因序列以及核糖體DNA ITS2序列進(jìn)行比較，分析二斑葉螨和朱砂葉螨各地理種群?jiǎn)柕姆肿舆z傳結(jié)構(gòu)，并對(duì)二者之間在分子水平上的差異進(jìn)行深入探討。 一、試驗(yàn)材料的采集和飼養(yǎng) 在全國(guó)范圍內(nèi)選擇較有代表性的地區(qū)分別對(duì)二斑葉螨和朱砂葉螨進(jìn)行采樣，二斑葉螨采集于全國(guó)13個(gè)省、市、自治區(qū)，朱砂葉螨采集了27個(gè)地理種群，采集的生境主要是果園、花圃和蔬菜地。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)采用隔水法在菜豆(Phase

4、olusvulgaeia L.)葉片上進(jìn)行恒溫恒濕隔離飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為25±1℃，L16：D8，相對(duì)濕度60％。 二、 測(cè)定COI和ITS2的序列，并對(duì)各不同地理種群進(jìn)行比較 mtDNA是研究分子遺傳和分子進(jìn)化的一種重要模式體系，各基因區(qū)域被廣泛用于分析昆蟲不同分類水平的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，其中細(xì)胞色素氧化酶I(COI)基因經(jīng)常被用來分析親緣關(guān)系較近的種、種下分類階元以及地理種群之間的系統(tǒng)關(guān)系。核糖體DNA(rDNA)第2內(nèi)

5、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS2)中度保守，在昆蟲和螨類的近緣種區(qū)分上應(yīng)用較多。借鑒別的昆蟲或蜱螨的mtDNA中COI以及核糖體DNA的ITS2的測(cè)定方法，測(cè)定所有種群的COI和ITS2序列。每個(gè)地理種群隨機(jī)抽取3～5個(gè)樣本進(jìn)行序列測(cè)定，以它們的一致序列為準(zhǔn)。 利用“BLAST”工具(NCBI站點(diǎn))對(duì)測(cè)定的序列進(jìn)行分析、DNA序列檢索；用GenDoc軟件進(jìn)行序列同源性比較；用BioEdit軟件進(jìn)行序列編輯；用ClustalX軟件進(jìn)行序列比較

6、(alignment)；比對(duì)結(jié)果輸入MEGA2.1軟件，采用距離法計(jì)算各樣品間的遺傳距離，并基于Kimura-2 Parameter模型，用鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自展1000次檢驗(yàn)獲得系統(tǒng)樹分支的置信度。三、基于線粒體DNA-COI基因序列，對(duì)我國(guó)二斑葉螨和朱砂葉螨各地理種群進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析 測(cè)定了我國(guó)二斑葉螨13個(gè)地理種群和朱砂葉螨27個(gè)地理種群的mtDNA細(xì)胞色素氧化酶亞基COI的中央片

7、段序列，最終從這些地理種群中都擴(kuò)增出了453bp的COI基因片段。在獲得的二斑葉螨COI序列比較中我們發(fā)現(xiàn)：整個(gè)序列共有36個(gè)堿基位點(diǎn)具有多樣性，占全長(zhǎng)的7.9％，其中88.9％為沉默替換；除新疆種群外，其他12個(gè)種群相互間的核苷差異都低于1.77％；新疆種群與其他12個(gè)種群的核苷差異平均為4.68％。朱砂葉螨種內(nèi)核酸差異分析顯示整個(gè)序列共有86個(gè)堿基位點(diǎn)具有多樣性，占全長(zhǎng)的19.0％，其中89.5％為沉默替換。利用鄰接法(neighb

8、or-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，我們發(fā)現(xiàn)：二斑葉螨各地理種群中，新疆種群和其他的12個(gè)種群親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，在兩個(gè)不同的支序上，因此，中國(guó)的二斑葉螨可以分為兩個(gè)不同的世系；二斑葉螨的新疆種群與地中海種群親緣關(guān)系較近，在同一個(gè)支序上，因此，新疆種群可能是從地中海地區(qū)傳入中國(guó)的；由中國(guó)朱砂葉螨27個(gè)地理種群和國(guó)外紅色型二斑葉螨6個(gè)種群所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹也將所有的序列劃分為兩個(gè)主要的分支，各分支中各地理種群之間的親緣關(guān)系互不相同。二斑

9、葉螨和朱砂葉螨各地理種群間的COI序列均有顯著差異，經(jīng)分析，我們認(rèn)為導(dǎo)致這些地理種群之間親緣關(guān)系互不相同的原因可能是由于一些生態(tài)和地理因素，比如寄主條件、氣候條件、感染W(wǎng)olbachia、地理隔離等。四、基于核糖體DNA-ITS2基因序列，對(duì)我國(guó)二斑葉螨和朱砂葉螨各地理種群進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析 為了了解中國(guó)二斑葉螨和朱砂葉螨各地理種群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，我們采用直接測(cè)序法對(duì)核糖體DNA中的ITS2區(qū)段序列進(jìn)行測(cè)定和分析。應(yīng)用通用(保守)引物

10、，通過PCR對(duì)我國(guó)二斑葉螨13個(gè)地理種群和朱砂葉螨27個(gè)地理種群的rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)進(jìn)行擴(kuò)增，最終從這些地理種群中都擴(kuò)增出了645bp左右的ITS2片段。通過對(duì)這些ITS2序列的比較分析，我們發(fā)現(xiàn)：二斑葉螨13個(gè)地理種群的ITS2序列完全一致，這可能是因?yàn)槎呷~螨的ITS2區(qū)段原本多態(tài)性就很低導(dǎo)致的；朱砂葉螨ITS2序列中的G+C含量為35.66％～36.28％；所有朱砂葉螨地理種群的序列共有12處不同，其中5個(gè)顛換、6

11、個(gè)轉(zhuǎn)換和1個(gè)2bp的插入／缺失，多態(tài)性位點(diǎn)的數(shù)量明顯少于COI，這也證明了ITS2的多態(tài)性比COI低。從系統(tǒng)發(fā)育樹我們可以看出：中國(guó)的二斑葉螨與日本的二斑葉螨親緣關(guān)系較近，被分在同一支上，而與歐洲及美洲的11個(gè)種群親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；中國(guó)朱砂葉螨27個(gè)地理種群被劃分為兩個(gè)主要的分化枝，同COI序列表現(xiàn)出的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系一致。 與ITS2序列相比，相同葉螨各地理種群之間的COI序列有較大差異，我們推斷各地理種群的ITS2序列之所以比COI

12、序列差異少可能是因?yàn)槿~螨ITS2的多態(tài)性原本就比COI的多態(tài)性低。由于二斑葉螨ITS2序列完全一致，我們不能全面地了解中國(guó)二斑葉螨各地理種群之間的關(guān)系，所以為了能深入地探討二斑葉螨種內(nèi)的差異，我們需要重新選擇其它分子標(biāo)記。另外，經(jīng)分析，導(dǎo)致朱砂葉螨各地理種群之間的ITS2序列有差異的原因可能是由于一些生態(tài)和地理因素，比如寄主條件、氣候條件、感染W(wǎng)olbachia、地理隔離等。 五、 我國(guó)二斑葉螨和朱砂葉螨在分子水平上的差異分析

13、 二斑葉螨和朱砂葉螨是世界上重要的農(nóng)業(yè)害螨，在過去的幾十年里國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)二者是否為同一種一直存在著很大的爭(zhēng)議。為了在分子水平上揭示二斑葉螨和朱砂葉螨的差異，深入探討二者的遺傳進(jìn)化關(guān)系，本文對(duì)我國(guó)二斑葉螨13個(gè)地理種群與朱砂葉螨27個(gè)地理種群的mtDNA-COI基因序列和rDNA-ITS2序列進(jìn)行比較和分析，從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中我們可以看出：在mtDNA-COI基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹中，朱砂葉螨和二斑葉螨很難被區(qū)分開來；而在rDNA

14、-ITS2序列的系統(tǒng)發(fā)育樹中，所有的二斑葉螨被劃分在同一分支中，并且同朱砂葉螨分隔開來。因此，我們推斷朱砂葉螨和二斑葉螨可能不是同一個(gè)種。經(jīng)分析，COI基因序列較適合于各地理種群間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分析，而ITS2序列則較適合于種間關(guān)系的分析。 綜上所述，本研究通過比較mtDNA COI基因序列和核糖體DNA ITS2序列的差異，揭示了二斑葉螨和朱砂葉螨各地理種群之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，這將有助于我們了解它們?nèi)肭滞緩胶捅l(fā)機(jī)制，為有效地