1、食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,我國特別是河南等省份是食管癌的高發(fā)地區(qū),其死亡率居惡性腫瘤的第4位。由于浸潤、轉(zhuǎn)移是引起食管癌患者死亡的主要原因,因此對食管癌浸潤轉(zhuǎn)移機制的研究已成為當(dāng)前研究的熱點課題。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多因素、多步驟、多階段和多基因參與并發(fā)生改變的過程,原癌基因的激活和抑癌基因的功能失活是人類腫瘤形成和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ),以往對抑癌基因的研究發(fā)現(xiàn),p53、Rb和p16等的突變和缺失與多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。RECK(r

2、eversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs,RECK)是Takahashi新近發(fā)現(xiàn)的一種新型轉(zhuǎn)移抑制基因,研究表明,該基因的表達與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移及血管生成密切相關(guān)。近年來,圍繞RECK與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移這一主題,先后有肝癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌等相關(guān)文獻報道。研究表明,RECK基因表達量與腫瘤的侵襲力呈負相關(guān),且RECK基因表達較高的患者預(yù)后往往也明顯好于表達量低的患者

3、,該基因缺失或/和突變及mRNA或蛋白表達降低與腫瘤的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分級有關(guān),其機制可能與RECK通過抑制MMP-2、MMP-9及MT1-MMP的分泌活性,從而對腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移具有負性調(diào)控作用有關(guān)。另外,RECK還可通過抑制腫瘤血管生成而抑制腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。有關(guān)在食管癌中RECK的表達及其與食管鱗癌浸潤轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究,除本課題組前期發(fā)表的相關(guān)文章外,迄今國內(nèi)外未見其他文獻報道。
　　為深入探討RECK基因與食

4、管鱗癌發(fā)生和浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系,尋求早期檢測食管鱗癌發(fā)生和浸潤轉(zhuǎn)移的指標(biāo)及尋找抑制食管鱗癌發(fā)生和浸潤轉(zhuǎn)移的有效方法,本研究首先采用RT-PCR、原位雜交及免疫組化SP法聯(lián)合檢測了食管癌新鮮手術(shù)切除標(biāo)本中RECK、MMP-9mRNA和蛋白的表達水平;采用免疫組化SP法檢測了食管鱗癌、癌旁不典型增生組織及正常食管粘膜組織中血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)的表達情況,同時用抗CD105抗體檢測了62例食管鱗癌中微血管密度(MVD),探討了RECK

5、與VEGF、MVD的相關(guān)性,以揭示RECK與食管癌浸潤、轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上,成功構(gòu)建了RECK真核表達載體,然后將其轉(zhuǎn)染入食管癌EC9706細胞中,分別應(yīng)用RT-PCR、原位雜交聯(lián)合檢測了食管癌EC9706細胞中RECK、MMP-gmRNA表達水平;以免疫組化SP法和Western blot法聯(lián)合檢測了食管癌新鮮手術(shù)切除標(biāo)本中RECK、MMP-9蛋白的表達水平;運用Boyden chamber侵襲實驗技術(shù)觀察轉(zhuǎn)染細胞體外侵襲力的

6、改變。最后通過裸鼠移植瘤實驗,采取原位雜交、RT-PCR、免疫組織化學(xué)、聯(lián)合檢測了RECK、MMP-9等在裸鼠移植瘤中的表達情況,從基因、蛋白、細胞定位及腫瘤細胞生物學(xué)行為、體外細胞侵襲實驗、體內(nèi)裸鼠成瘤實驗等多個方面深入探討上調(diào)RECK的表達及活性對抑制食管癌侵襲的作用,試圖闡明RECK的表達在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤、轉(zhuǎn)移中的意義;并進一步闡明RECK基因抑制食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤、轉(zhuǎn)移的機制是否與下調(diào)VEGF表達、降低腫瘤中的M

7、VD有關(guān)。為進一步探討食管鱗癌發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移機制及尋找抑制食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展的途徑提供理論基礎(chǔ)。本研究共分以下4個部分。
　　第一部分RECK在食管鱗癌組織中的表達及臨床意義
　　方法:1.采用免疫組織化學(xué)的方法檢測62例食管鱗癌組織、31例癌旁不典型增生組織及62例正常食管粘膜組織之中RECK基因蛋白的表達情況,并進行形態(tài)學(xué)觀察。
　　2.采用RT-PCR方法檢測62例食管鱗癌組織、31例癌旁不典型增生組織及62例

8、正常食管粘膜組織之中RECK基因mRNA的表達情況,并進行形態(tài)學(xué)觀察。
　　3.采用原位雜交方法檢測62例食管鱗癌的癌組織、31例癌旁不典型增生組織、62例正常食管粘膜組織之中RECK基因mRNA的表達情況,并進行形態(tài)學(xué)觀察。
　　4.統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS11.0軟件處理,采用χ2檢驗、t檢驗和方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果:1.RECK mRNA及蛋白陽性表達主要位于正常食管粘膜鱗狀上皮細胞的胞質(zhì)內(nèi),

9、在腫瘤細胞內(nèi)無表達或者表達量較低。
　　2.RT-PCR和原位雜交聯(lián)合檢測結(jié)果顯示:在正常食管粘膜組織、癌旁不典型增生組織和食管鱗癌組織中,RECK mRNA表達水平依次降低,三者組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。免疫組織化學(xué)方法檢測結(jié)果顯示:在正常食管粘膜組織、癌旁不典型增生組織和食管鱗癌組織中,陽性表達率依次降低,三者組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.在浸達深肌層者和伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織中

10、,RECK mRNA陽性表達率較侵達淺肌層者和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者顯著降低,組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);在侵達深肌層者和伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌組織中,RECK蛋白陽性表達率較侵達淺肌層者和伴無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者在顯著降低,組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　4.在食管高分化、中分化及低分化鱗癌組織中,其RECK蛋白和mRNA陽性表達率均依次降低,組間比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低分化食管鱗癌比高、中分化食管鱗癌

11、RECK mRNA陽性表達率明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);低分化食管癌比高、中分化食管癌RECK蛋白陽性表達率明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　5.RECK mRNA表達與食管癌患者的性別、年齡、大體類型及腫瘤發(fā)生部位無關(guān)(P<0.05)。
　　第二部分MMP-9、VEGF及CD105在食管鱗癌組織中的表達及其與RECK基因關(guān)系的研究
　　方法:1.采用RT-PCR方法檢測62例食管鱗癌組

12、織、31例癌旁不典型增生組織及62例正常食管粘膜組織之中MMP-9 mRNA的表達情況及其相關(guān)性。
　　2.采用原位雜交方法檢測62例食管鱗癌組織、31例癌旁不典型增生組織及62例正常食管粘膜組織之中MMP-9 mRNA的表達情況及其相關(guān)性。
　　3.采用免疫組織化學(xué)的方法檢測62例食管鱗癌組織、31例癌旁不典型增生組織及62例正常食管粘膜組織之中MMP-9、VEGF的蛋白表達情況及起相關(guān)性,并進行形態(tài)學(xué)觀察。
　　4

13、.采用免疫組織化學(xué)的方法檢測62例食管鱗癌組織之中CD105蛋白表達的情況及其相關(guān)性研究,并進行形態(tài)學(xué)觀察。
　　5.統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS11.0軟件處理,采用χ~2檢驗、t檢驗和方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果:1.MMP-9 mRNA及蛋白陽性表達主要位于腫瘤細胞的胞質(zhì)內(nèi),在正常食管粘膜鱗狀上皮細胞內(nèi)無表達或者表達量較低。MMP-9蛋白及mRNA在三樣品中表達與RECK的表達均呈負相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。

14、
　　2.浸潤深度達深層者和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌組織中,MMP-9蛋白及mRNA表達較浸潤深度達淺層者和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的顯著升高,組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.低分化食管癌比高、中分化食管鱗癌MMP-9蛋白及mRNA陽性表達顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　4.VEGF蛋白陽性表達主要位于腫瘤細胞的胞質(zhì)內(nèi)。正常食管粘膜組織、癌旁不典型增生組織和食管癌組織中VEGF蛋白表達水平依次升高,

15、三者組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。食管鱗癌組織中VEGF蛋白表達與食管鱗癌組織的浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。其蛋白表達與RECK蛋白表達呈負相關(guān)關(guān)系,與MMP-9蛋白表達呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。
　　5.CD105蛋白陽性表達主要位于腫瘤間質(zhì)的血管內(nèi)皮細胞的胞漿中。CD105在浸潤深度達深肌層和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的蛋白陽性表達率較浸潤深度達淺層者和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的顯著降低,組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其蛋白

16、表達與RECK蛋白表達呈負相關(guān)關(guān)系,與MMP-9及VEGF蛋白表達呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。
　　6.MMP-9 mRNA、蛋白表達及VEGF及CD105蛋白表達與食管癌患者的性別、年齡、等無關(guān)(P>0.05)。
　　第三部分人RECK基因的分子克隆和真核表達載體的構(gòu)建及其對人食管癌細胞株EC9706生物學(xué)行為的影響
　　方法:1.從食管組織中提取總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴增出人RECK基

17、因;限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和NotⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和pcDNA3質(zhì)粒,然后用T4 DNA Ligase連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞,PCR驗證轉(zhuǎn)化子,挑取陽性克隆擴大培養(yǎng),提取其質(zhì)粒,進行KpnⅠ和NotⅠ雙酶切驗證構(gòu)建RECK基因的真核表達載體pcDNA3-RECK并經(jīng)酶切鑒定。
　　2.采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)將真核表達載體pcDNA3-RECK導(dǎo)入體外培養(yǎng)的食管癌EC9706細胞。
　

18、　3.采用RT-PCR、原位雜交方法檢測轉(zhuǎn)染前、后RECK及MMP-9在人食管癌細胞株EC9706 mRNA的表達情況。
　　4.采用免疫細胞化學(xué)、Western blot的方法檢測轉(zhuǎn)染前、后RECK及MMP-9在人食管癌細胞株EC9706蛋白的表達情況。
　　5.細胞計數(shù)法繪制各組細胞的生長曲線以觀察RECK基因?qū)毎鲋衬芰Φ挠绊憽?br>　　6.Boyden chamber實驗計算各組穿膜的細胞數(shù)以比較轉(zhuǎn)染RECK基因

19、對細胞侵襲能力的變化。
　　7.統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS11.0軟件處理,采用χ2檢驗、方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果:1.PCR擴增得到了特異性的4.4kb基因片段?；蚱蔚拇笮∨c預(yù)期一致。所獲得的RECK基因測序及BLAST分析證明克隆的人RECK基因序列正確,pcDNA3-RECK經(jīng)酶切后得到5.4kb和4.4kb兩個片段。
　　2.PCR鑒定、酶切鑒定pcDNA3-RECK重組載體,結(jié)果顯示:PC

20、R擴增片段及KpnⅠ和NotⅠ雙酶切片段大小與設(shè)計相符。
　　3.DNA測序結(jié)果證明:所構(gòu)建真核表達載體上的目的基因核苷酸序列與GenBank上基因預(yù)計部分完全一致,且方向正確。
　　4.轉(zhuǎn)染pcDNA3-RECK真核表達載體后,EC9706細胞均能穩(wěn)定高表達RECKmRNA及蛋白。
　　5.Boyden chamber體外侵襲實驗結(jié)果顯示:與空白對照組相比,EC9706pcDNA3-RECK組穿越Matrigel膠的

21、細胞數(shù)顯著減少(P<0.05),而pcDNA3空質(zhì)粒組及空白對照組之間則無明顯差異(P>0.05)。
　　第四部分RECK基因?qū)β闶笠浦擦錾L的抑制作用及機制研究
　　方法:1.分別將轉(zhuǎn)染前、后及空質(zhì)粒組的食管癌細胞株EC9706注入裸鼠皮下,比較各組裸鼠成瘤大小。
　　2.分別應(yīng)用RT-PCR、原位雜交方法檢測各組裸鼠腫瘤組織中RECK、MMP-9基因的mRNA表達情況。
　　3.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測各組裸

22、鼠腫瘤組織中RECK、MMP-9、VEGF基因的蛋白表達情況。
　　4.統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS11.0軟件處理,采用χ2檢驗、方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果:1.EC9706細胞組、EC9706/pcDNA3細胞組裸鼠移植瘤體積顯著大于EC9706/pcDNA3-RECK組裸鼠移植瘤體積,組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　2.EC9706細胞組、EC9706/pcDNA3細胞組裸鼠移植瘤R

23、ECK基因蛋白及mRNA表達顯著低于EC9706/pcDNA3-RECK的表達,組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.EC9706細胞組、EC9706/pcDNA3細胞組裸鼠移植瘤MMP-9基因蛋白及mRNA表達顯著高于EC9706/pcDNA3-RECK的表達,組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　4.EC9706細胞組、EC9706/pcDNA3細胞組裸 鼠移植瘤VEGF基因蛋白表達顯著高于E

24、C9706P/cDNA3一REcK的表達，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:1、食管鱗癌組織中RECK蛋白及mRNA呈低表達。
　　2、RECK可能是食管鱗癌侵襲、轉(zhuǎn)移的重要生物學(xué)標(biāo)記。
　　3、RECK在腫瘤的演進中具有重要的作用。
　　4、成功構(gòu)建了RECK真核表達載體pcDNA3-RECK，并成功導(dǎo)入人食管癌EC9706細胞株中，篩選出了穩(wěn)定細胞株，為進一步研究RECK的生物學(xué)功能和RE