1、超抗原是一種具有強(qiáng)大免疫刺激功能的新型蛋白質(zhì)抗原，業(yè)已證明超抗原參與多種疾病的發(fā)病過程。金黃色葡萄球菌(金葡菌)腸毒素超抗原家族涉及的疾病譜非常廣泛，并且也是一種失能型的生物戰(zhàn)劑，一直是比較活躍的研究領(lǐng)域。已取得的研究進(jìn)展提示我們，目前針對金葡菌腸毒素超抗原所致疾病除了臨床對癥支持治療外，尚無很好的針對超抗原的治療手段，因此，從其超抗原特性入手，尋找有效控制腸毒素毒性作用的方法，可以進(jìn)一步為相關(guān)疾病的防治研究和生物武器防護(hù)提供新的手段。

2、 SEA、SEB、SEC和SED是常見的毒性作用較強(qiáng)的金葡菌腸毒素，國內(nèi)外對其研究內(nèi)容大多數(shù)是利用其超抗原免疫活性進(jìn)行抗腫瘤臨床治療等，針對超抗原的活性本身來研究超抗原相關(guān)疾病的防治手段較少。目前的研究主要是針對腸毒素的免疫識別區(qū)域設(shè)計(jì)小分子多肽和構(gòu)建并篩選腸毒素的減毒突變體，從這兩方面研究抑制腸毒素超抗原的活性的手段。但是大多數(shù)研究都是對單一種類的腸毒素研究，針對多種腸毒素的廣譜抑制性手段的研究很少。 基于上述問題，

3、我們針對葡萄球菌腸毒素同源序列設(shè)計(jì)了9條小分子多肽，通過細(xì)胞模型篩選具有廣譜抑制性的多肽分子，并運(yùn)用動物模型檢測篩選到的抑制性多肽對動物的保護(hù)作用，研究抑制性肽與MHCII類分子的親和力，預(yù)測抑制性肽的空間結(jié)構(gòu)，探討其廣譜抑制活性的機(jī)制；同時(shí)構(gòu)建了SED減毒突變體，并檢測了該突變體的促人PBMC增殖活性、MHC II類分子結(jié)合活性和TCRvp特異性。主要研究內(nèi)容和結(jié)果包括以下幾方面： 1.抑制性多肽的設(shè)計(jì)和合成，對金葡菌腸毒素家

4、族的序列進(jìn)行比較，選擇具有同源性的保守序列設(shè)計(jì)多肽，共設(shè)計(jì)了9條多肽。 2.建立人外周血單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞模型，檢測9條合成多肽對超抗原的抑制效應(yīng)。主要從多肽對SEs刺激人PBMC的增殖和分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β的抑制效應(yīng)進(jìn)行檢測，篩選具有廣譜抑制性效應(yīng)的多肽，試驗(yàn)結(jié)果顯示多肽P72對SEA、SEB和SEC超抗原活性具有明顯抑制作用，其他8條多肽對SEs的抑制作用不明顯。確證試驗(yàn)顯示P72對PHA、ConA的促PBMC

5、增殖活性無抑制作用。 3.建立8周齡雌性BALB/c小鼠感染性休克的動物模型，以脂多糖(LPS)和D-氨基半乳糖(D-GalN)致敏小鼠，再用不同劑量的SE進(jìn)行攻擊，獲得了此條件下SEA、SEB和SEC的最低致死劑量。利用該動物模型檢測多肽P72對SEA、SEB和SEC攻擊小鼠的保護(hù)效果，結(jié)果顯示P72對SEA、SEB和SEC致休克效應(yīng)具有顯著的保護(hù)作用。 4.競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測抑制性多肽P72與MHCII類分子的結(jié)合活性

6、，結(jié)果顯示多肽P72不能與SEA、SEB和SEC有效競爭結(jié)合Raji細(xì)胞上的MHC II類分子，提示P72可能不是通過與MHCII類分子結(jié)合產(chǎn)生的抑制活性。 5.對抑制性多肽P72的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，將P72在SEA、SEB、SEC的同源序列的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比，結(jié)果顯示3種超抗原與P72同源的序列在空間結(jié)構(gòu)上具有高度的相似性。 6.構(gòu)建了SEDN23A/H26R突變體。并對突變體蛋白進(jìn)行純化、定量和免疫印跡分析。檢測了S

7、EDN23A/H26R突變體促T淋巴細(xì)胞增殖的活性，結(jié)果顯示其促增殖活性比SED顯著降低；以競爭實(shí)驗(yàn)檢測SEDN23A/H26R突變體與MHC II類分子的結(jié)合活性，并用流式細(xì)胞儀檢測突變體TCRvp特異性變化。結(jié)果：突變體SEDN23A/H26R與MHCII類分子的親合力未發(fā)生變化，但刺激人TCRVβ5+T細(xì)胞水平顯著降低。 綜上，本研究設(shè)計(jì)并篩選到了1條廣譜抑制性多肽P72，P72能夠在體外和體內(nèi)顯著抑制SEA、SEB、SE