1、目的：構(gòu)建針對(duì)NF-κB p65基因的RNAi腺病毒表達(dá)載體，從轉(zhuǎn)錄后水平抑制p65基因表達(dá)，為研究NF-κB信號(hào)通路提供技術(shù)工具；并利用構(gòu)建的RNAi腺病毒感染血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制．p65表達(dá)，觀察NF-κB信號(hào)通路對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 方法：設(shè)計(jì)合成三對(duì)針對(duì)p65 mRNA不同位點(diǎn)的shRNA編碼序列，克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒中，然后通過(guò)體外同源重組構(gòu)建重組。RNAi腺病毒表達(dá)載體；在HEK293A細(xì)胞中包裝并擴(kuò)增病毒

2、、空斑實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，獲得高滴度的病毒上清；腺病毒感染血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304株，Western Blot和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)構(gòu)建的RNAi腺病毒對(duì)p65表達(dá)的抑制效果，并探討不同的感染復(fù)數(shù)(MOI值)及病毒感染后不同時(shí)間對(duì)p65抑制效應(yīng)的影響；利用RNAi腺病毒抑制1965表達(dá)，探討NF-κB信號(hào)通路對(duì)ECV304細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 結(jié)果：1．成功構(gòu)建了針對(duì)p65基因三個(gè)不同位點(diǎn)的RNAi腺病毒表達(dá)載體，經(jīng)PCR和

3、測(cè)序鑒定干擾片段的堿基序列及插入位點(diǎn)完全正確；2．在HEK293A細(xì)胞中包裝、擴(kuò)增腺病毒，獲得高滴度腺病毒上清；測(cè)定擴(kuò)增第二代的病毒液滴度在3.0×10<'9>pfu～2.5×10<'10>pfu之間，可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要；3．構(gòu)建的三個(gè)RNAi腺病毒感染ECV304細(xì)胞后均可使p65表達(dá)量明顯下降，RNAi腺病毒MOI值15～25即可以實(shí)現(xiàn)對(duì)ECV304細(xì)胞p65表達(dá)的有效抑制；4.RNAi腺病毒感染ECV304細(xì)胞后48h開(kāi)始檢測(cè)到p

4、65表達(dá)量下降，且隨時(shí)間延長(zhǎng)p65表達(dá)量進(jìn)一步減少，抑制效應(yīng)可持續(xù)六天以上；5．腺病毒感染ECV304細(xì)胞3d、5d、7d后MTT檢測(cè)，RNAi腺病毒組與空病毒組相比，細(xì)胞增殖率明顯下降(p<0.05或p<0.01)：但流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果提示對(duì)ECV304細(xì)胞凋亡的影響不明顯。 結(jié)論：構(gòu)建NF-κB p65特異的RNAi腺病毒表達(dá)載體能有效抑制p65基因的表達(dá)，可以作為研究NF-κB信號(hào)通路的重要技術(shù)手段；NF-κB信號(hào)通路對(duì)正常