1、第一部分　低氧預處理對缺氧/復氧損傷導致的骨髓基質干細胞的保護作用及凋亡轉導信號通路的影響　　采用密度梯度離心法分離獲取80克SD骨髓基質干細胞，以密度梯度離心和貼壁篩選法純化骨髓基質干細胞。取傳代后第三代細胞進行細胞形態(tài)學和流式細胞學鑒定，進入實驗。培養(yǎng)后的三代骨髓基質干細胞細胞分為6組： 一組：正常的骨髓基質干細胞； 二組：缺氧/復氧組； 三組：0.5uM環(huán)孢霉素+缺氧/復氧； 四組：低氧預處理10

2、分鐘+缺氧/復氧； 五組：低氧預處理20分鐘+缺氧/復氧； 六組：低氧預處理30分鐘+缺氧/復氧。 采用TNNEL檢測各組的凋亡指數(shù)，并且應用MTT法檢測各組之間的細胞活力以證實低氧預處理是否對缺氧/復氧損傷是否有保護作用。以熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位、Western—blotting方法觀察各組線粒體膜電位細胞外調節(jié)激酶-1/2、Akt、缺氧誘導因子1-α(hypoxia-inducible factor 1，

3、HIF-1α)，血管內皮生長因子(the vascular endothelial growth。factor，VEGF)和Bcl-2等蛋白的變化情況，以闡明低氧預處理的作用機制。 結果： 1.骨髓基質干細胞鑒定：體外培養(yǎng)的骨髓基質干細胞呈成纖維細胞樣貼壁生長，流式細胞學檢測骨髓基質干細胞膜表面CD分子表達情況。細胞膜CD分子的表達率：CD90-99.4％；CD44—86.5％；CD45—4.47％，這符合骨髓基質干細胞

4、的特征。 2.低氧預處理預防缺氧/復氧誘導的骨髓基質干細胞凋亡并增加細胞活力： 在正常的培養(yǎng)條件下，大約3％的骨髓基質干細胞是TUNEL-陽性的細胞核，與以前報道的一致。與正常條件培養(yǎng)的干細胞相比，經6小時的缺氧和12小時復氧之后缺氧/復氧明顯增加TUNEL-陽性的細胞，凋亡率為48.2±3.1％，與正常細胞組相比具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。 3.低氧預處理保護缺氧/復氧損傷誘導的線粒體膜電位的衰減：

5、 正常的骨髓基質干細胞顯示紅色熒光，提示線粒體膜電位正常，而經缺氧/復氧誘導之后顯示綠色熒光增多，提示膜電位衰減。低氧預處理和環(huán)孢霉素組綠色熒光明顯減少，這提示低氧預處理和環(huán)孢霉素對線粒體膜電位衰減有保護作用。 4.低氧預處理對缺氧/復氧誘導的Bcl-2和BAX表達的影響： 當骨髓基質干細胞在缺氧/復氧的環(huán)境中時，線粒體Bcl-2蛋白表達增加2.3±0.18倍，與正常骨髓基質干細胞相比具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。然而

6、，低氧預處理能夠更加明顯增加Bcl-2表達，高于缺氧/復氧組，低氧預處理10分鐘組為正常細胞的3.3±0.11倍，低氧預處理20分鐘組為正常細胞的3.4±0.23倍，低氧預處理30分鐘組為正常細胞的3.8±0.11倍，與缺氧/復氧組具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。0.5uM CsA也可以增加線粒體部分Bcl-2蛋白表達，為正常細胞的2.68±0.18倍，與缺氧/復氧組具有統(tǒng)計學差異(JD<0.05)。 5.低氧預處理對缺氧/復氧

7、誘導的ERK-1/2的影響： 當骨髓基質干細胞經過缺氧/復氧處理后磷酸化ERK減少，為正常細胞的0.44±0.17倍，與正常細胞比較有統(tǒng)計學差異(JID<0.05)．然而這種作用可以被低氧預處理所逆轉，經過低氧預處理后磷酸化ERK增加，低氧預處理10分鐘組為正常細胞的0.80±0.16倍，低氧預處理20分鐘組為正常細胞的0.91±0.03倍，低氧預處理30分鐘組為正常細胞的1.04±0.04倍，與缺氧/復氧組具有統(tǒng)計學差異(P<

8、0.05) 6.低氧預處理對缺氧/復氧誘導的的Akt影響： 當缺氧/復氧組骨髓基質干細胞磷酸化Akt表達減少，為正常細胞的0.39±0.14倍，與正常細胞比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。然而這種作用可以被低氧預處理所逆轉，并且低氧預處理可以時間依賴性的升高，低氧預處理10分鐘組為正常細胞的0.43±0.13倍，低氧預處理20分鐘組為正常細胞的0.47±0.12倍，低氧預處理30分鐘組為正常細胞的0.73±0.014倍，

9、與缺氧/復氧組具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。 7.低氧預處理對缺氧/復氧誘導的HIF1-α和VEGF的影響： 經過在6小時缺氧和12小時后，HIF1-α在缺氧/復氧組和低氧預處理組沒有明顯的變化。然而，VEGF的表達在缺氧/復氧組要比正常細胞組增加1.89±0.15倍，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。同時，低氧預處理組VEGF也明顯增加，并且明顯高于缺氧/復氧組，低氧預處理10分鐘組為正常細胞的2.37±0.12倍，低

10、氧預處理20分鐘組為正常細胞的2.40±0.10倍，低氧預處理30分鐘組為正常細胞的2.44±0.11倍，與缺氧/復氧組具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。 第二部分　環(huán)孢霉素A對缺氧/復氧損傷導致的骨髓基質干細胞的保護作用及凋亡轉導信號通路的影響　　采用密度梯度離心法分離獲取80克SD骨髓基質干細胞，以密度梯度離心和貼壁篩選法純化骨髓基質干細胞。取傳代后第三代細胞進行細胞形態(tài)學和流式細胞學鑒定，進入實驗。培養(yǎng)后的三代骨髓間質干細

11、胞細胞分為6組： 一組：正常的骨髓問質干細胞； 二組：缺氧/復氧組； 三組：0.5uM環(huán)孢霉素A+缺氧/復氧； 四組：5uM環(huán)孢霉素A+缺氧/復氧。采用TNNEL檢測各組的凋亡指數(shù)，并且應用MTT法檢測各組之間的細胞活力以證實環(huán)孢霉素A是否對缺氧/復氧損傷是否有保護作用。以熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位、Western-blotting方法觀察各組細胞色素C、細胞外調節(jié)激酶-1/2、Bad、Bcl-2和bax

12、表達的變化情況，以明確低氧預處理的作用機制。 結果： 1.骨髓基質干細胞鑒定：體外培養(yǎng)的骨髓基質干細胞呈成纖維細胞樣貼壁生長，流式細胞學檢測骨髓基質干細胞膜表面CD分子表達情況。細胞膜CD分子的表達率：CD90-99.4％；CD44-86.5％；CD45-4.47％，這符合骨髓基質干細胞的特征。 2.環(huán)孢霉素A預防缺氧/復氧誘導的骨髓基質干細胞凋亡并增加細胞活力： 在正常的培養(yǎng)條件下，大約3％的骨髓基質干

13、細胞是TUNEL-陽性的細胞核。與正常條件培養(yǎng)的干細胞相比，經6小時的缺氧和12小時復氧之后缺氧/復氧明顯增加TUNEL-陽性的細胞，凋亡率為48.2±3.1％，與正常細胞組相比具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。 三、環(huán)孢霉素A對缺氧/復氧損傷誘導的線粒體膜電位的影響： 正常的骨髓基質干細胞顯示紅色熒光，提示線粒體膜電位正常，而經缺氧/復氧誘導之后顯示綠色熒光增多，提示膜電位衰減。環(huán)孢霉素A組綠色熒光明顯減少，這提示環(huán)孢霉

14、素A對線粒體膜電位衰減有保護作用。 四、環(huán)孢霉素A對缺氧/復氧損傷誘導細胞色素C轉位的影響： 當骨髓基質干細胞在缺氧/復氧的條件下，骨髓基質干細胞細胞色素C從線粒體轉移到細胞漿，是正常細胞的1.4±0.04倍，與正常細胞比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。0.5-5uM環(huán)孢霉素A可以減少缺氧/復氧誘導的細胞色素C釋放(P<0.05)，同時，總的細胞色素C表達無論是缺氧/復氧組還是環(huán)孢霉素A都沒有明顯變化(P>0.05)。

15、 五、環(huán)孢霉素A對缺氧/復氧誘導的Bcl-2和BAX表達的影響： 當骨髓基質干細胞在缺氧/復氧的環(huán)境中時，總Bcl-2蛋白表達增加4.5±1.3倍，與骨髓基質干細胞正常相比具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。 六、環(huán)孢霉素A對缺氧/復氧誘導的ERK-1/2的影響當骨髓基質干細胞經過缺氧/復氧處理后磷酸化ERK減少，與正常細胞比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。然而這種作用可以被壞孢霉素A所逆轉，經過5uM環(huán)孢霉素A預孵育

16、后磷酸化ERK1/2減少，5 uM環(huán)孢霉素A組與缺氧/復氧組具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。而0.5 uM壞孢霉素A組與缺氧/復氧組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。環(huán)孢霉素A不影響ERK1/2表達。 七、環(huán)孢霉素A對缺氧/復氧誘導的的Bad和磷酸化Bad影響在缺氧/復氧組磷酸化的Bad明顯減少，與正常細胞組相比具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。環(huán)孢霉素A可以預防缺氧/復氧誘導的磷酸化Bad減少，0.5 uM環(huán)孢霉素A為正常細胞的0.