1、目的:采用蛋白質組學技術,檢測健康志愿者與慢性乙型病毒性肝炎(簡稱慢性乙肝)濕熱中阻、肝郁脾虛、瘀血阻絡、肝腎陰虛及脾腎陽虛五種中醫(yī)證候患者外周血漿中差異表達的蛋白質,分析這些差異表達的蛋白質與機體免疫反應狀態(tài)之間的關系,初步探索出慢性乙肝各中醫(yī)證候所處免疫反應狀態(tài)之蛋白質組學規(guī)律,為臨床辨治慢性乙肝提供可供參考的客觀依據(jù),也為進一步探討慢性乙肝中醫(yī)證候的分子基礎提供線索。
　　 方法:依據(jù)《病毒性肝炎中醫(yī)辨證標準》,于2009

2、年10月-2010年9月期間,在瀘州醫(yī)學院附屬中醫(yī)醫(yī)院住院和門診的慢性乙肝患者中,收集典型的濕熱中阻證(Ⅱ)、肝郁脾虛證(Ⅲ)、脾腎陽虛證(Ⅳ)、肝腎陰虛證(Ⅴ)、瘀血阻絡證(Ⅵ)及健康正常人(Ⅰ)共105例作為研究對象。首先每種證型取5例樣本,對其血漿蛋白進行雙向凝膠電泳,切取標準化總灰度值(％Vol)相差達2倍以上,且在慢性乙肝五種中醫(yī)證候中均存在明顯規(guī)律性變化的差異表達蛋白點進行質譜分析,搜索SWISS—PROT數(shù)據(jù)庫,鑒定出以上

3、差異表達的蛋白質。在這些差異表達的蛋白質中篩選出能反映機體免疫反應狀態(tài)的蛋白質,擴大樣本量,每種證型取20例,正常對照組取5例,應用ELISA技術對以上差異表達蛋白進行驗證,分析這些差異表達的蛋白質與機體免疫反應狀態(tài)之間的關系,探索其中的蛋白質組學規(guī)律。
　　 結果:(1)獲得了分辨率和重復性均較好的血漿蛋白雙向電泳銀染圖譜,初步建立起慢性乙肝肝郁脾虛、濕熱中阻、肝腎陰虛、脾腎陽虛、瘀血阻絡證組及健康人對照組血漿蛋白質組表達圖譜

4、。(2)通過對比分析健康人對照組、慢性乙肝病人濕熱中阻證組、肝郁脾虛證組、瘀血阻絡證組、肝腎陰虛證組及脾腎陽虛證組的雙向電泳圖譜,在五種證候中均存在明顯規(guī)律性差異表達的蛋白點共有五個,通過質譜鑒定,確定為結合珠蛋白(HP)、免疫球蛋白J鏈(Ig-J)、視黃醇結合蛋白(RBP)、C-反應蛋白(CRP)、玻連蛋白(VN)。(3)選取其中主要與肝臟功能狀況相關的視黃醇結合蛋白(RBP)、結合珠蛋白(HPT)以及主要與機體體液免疫功能相關的免疫

5、球蛋白J鏈(Ig-J)進行ELISA法檢測,發(fā)現(xiàn)在各證候組中,反應肝臟功能狀況的蛋白質——視黃醇結合蛋白(RBP)、結合珠蛋白(HPT)均較正常對照組降低(P<0.05)。其中,各證候組視黃醇結合蛋白(RBP)與正常對照組比較均降低,其降低順序(降低最多排前)為:Ⅵ>Ⅴ>Ⅳ>Ⅲ>Ⅱ,中醫(yī)證候組間比較Ⅳ與Ⅲ間有顯著性差異(P<0.05)；各證候組結合珠蛋白(HPT)與正常對照組比較均降低,但組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在各證候組

6、中,反應機體體液免疫反應狀態(tài)的蛋白質——免疫球蛋白J鏈(Ig-J)均較正常對照組升高,升高順序為(升高最多排前)Ⅵ>Ⅴ>Ⅳ>Ⅲ>Ⅱ,各中醫(yī)證候組與正常組比較均有顯著性差異(P<0.05),且中醫(yī)證候組間比較均有顯著性差異(P<0.05)。
　　 結論:1.初步建立慢性乙肝肝郁脾虛組、濕熱中阻組、肝腎陰虛組、脾腎陽虛組、瘀血阻絡組及健康人對照組血漿蛋白質組表達圖譜。2.慢性乙肝五種中醫(yī)證型患者與正常人比較存在多個蛋白質表達差異,表

7、明慢性乙肝不同中醫(yī)證候患者存在多蛋白表達異常,此為中醫(yī)“證”本質研究奠定了科學基礎。3.在慢性乙肝五種證型中,反映機體體液免疫狀態(tài)的免疫球蛋白J鏈相對于正常對照組均升高,其中以瘀血阻絡證組升高最為明顯,其次為肝腎陰虛證組、脾腎陽證虛、肝郁脾虛證組,最低為濕熱中阻證組。提示慢性乙肝患者存在體液免疫功能紊亂,且不同證型之間免疫紊亂程度不同。其中,瘀血阻絡證組免疫紊亂最重,其次為肝腎陰虛證組、脾腎陽證虛、肝郁脾虛證組,濕熱中阻證組免疫紊亂最輕

8、。4.在慢性乙肝五種證型中,反應肝功能損害程度的視黃醇結合蛋白、結合珠蛋白與正常對照組比較均降低。其中,視黃醇結合蛋白以瘀血阻絡證組降低最明顯,其次為肝腎陰虛證組、脾腎陽虛組、肝郁脾虛證組,濕熱中阻證組最高。說明慢性乙肝各中醫(yī)證型患者均存在不同程度的肝功能損害,其中,以瘀血阻絡證肝功能損害最為嚴重,濕熱中阻證相對最輕。5.在慢性乙肝五種中醫(yī)證候中,肝功能損害程度與機體免疫功能紊亂之間存在正相關性,即免疫功能紊亂程度越重,其肝功能損害程度