1、牙周病是一類涉及到細菌微生物侵犯和宿主反應等因素影響的常見病之一；細菌是牙周炎的始動因素，但是細菌的作用可能會被宿主反應不同所改變。侵襲性牙周炎是常發(fā)生在全身健康的青少年和年輕成年人、以牙周支持組織快速降解破壞為特征的一類牙周炎；大量的遺傳學研究認為罹患侵襲性牙周炎的個體涉及遺傳易感因素。 迄今大多數(shù)遺傳基因易感因素和牙周病相關(guān)性研究主要采用候選基因多態(tài)性(polymorphisms)的關(guān)聯(lián)研究；已有研究多關(guān)注免疫系統(tǒng)和炎性因子

2、的基因，包括白介素-1(IL-1)，人類白細胞抗原（HLA），維生素D受體，F(xiàn)cγ受體等基因；實際上炎性因子刺激宿主細胞產(chǎn)生過量的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)，最終導致了牙周組織的降解和破壞。MMPs家族是由20多種鋅離子依賴性內(nèi)切酶組成，在胚胎發(fā)育、炎癥反應和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等中發(fā)揮重要作用；尤其在炎癥反應中加速白細胞募集、細胞因子釋放和促進基質(zhì)降解改建。明膠酶是MMPs家族的主要成員，

3、包括MMP-2(明膠酶A)和MMP-9(明膠酶B)；它們作用底物廣泛，包括IV型膠原、明膠、彈性蛋白等。MMP-2主要由成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和破骨細胞表達；MMP-9主要由中性粒細胞、巨噬細胞和單核細胞產(chǎn)生。MMPs的表達活化受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控、底物特異性、內(nèi)源性抑制劑—組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)三方面的平衡調(diào)節(jié)。大量臨床研究證實在牙周炎活躍期的齦溝液、牙

4、齦中包括MMP-2、MMP-9在內(nèi)的MMPs水平明顯升高，MMPs/TIMPs比例失衡。 近年來國內(nèi)外學者發(fā)現(xiàn)在不同種族中MMP-1啟動子區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與慢性牙周炎或侵襲性牙周炎易感性有一定相關(guān)性。促使人們把目光投向非炎癥系統(tǒng)的MMPs家族基因作為候選基因，探尋其基因多態(tài)性和牙周炎的關(guān)系。近來在MMP-2基因啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)-1306bp位點胞嘧啶替換為胸

5、腺嘧啶（C→T）形成SNP，改變了CCACC盒而影響轉(zhuǎn)錄水平；在MMP-9啟動子區(qū)-1562bp位點C→T產(chǎn)生的SNP對轉(zhuǎn)錄也產(chǎn)生顯著影響，T等位基因表達水平升高；TIMP-2基因啟動子區(qū)-418bp位點上鳥嘌呤轉(zhuǎn)換為胞嘧啶(G→C)，影響到Sp1結(jié)合位點導致TIMP-2基因轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)，進而可能影響到TIMP-2和MMP-2之間的平衡。本課題將對MMP-2，MMP-9和TIMP-2啟動子區(qū)基因多態(tài)性與侵襲性牙周炎相關(guān)性進行研究。

6、 牙周?？齐娮硬v是對牙周病臨床病例樣本進行牙周臨床指標統(tǒng)計分析的理想工具，對牙周臨床科研工作的開展起著不可替代的作用。隨著牙周病學研究的快速發(fā)展和口腔數(shù)字化管理的普及，亟需牙周?？齐娮硬v，加快國內(nèi)牙周電子病歷的研制開發(fā)勢在必行。為此本課題開發(fā)構(gòu)建了牙周?？齐娮硬v。 本課題還利用臨床搜集的AgP患者牙齦組織標本，應用免疫組織化學法對MMP-9、TIMP-2的表達進行定位及半定量分析，探討了MMP-9、TIMP-2在侵襲

7、性牙周炎不同基因型牙齦組織中的表達情況。 第一部分牙周電子病歷的構(gòu)建本研究 采用微軟IIS（Internet Information Server）的ASP(Active Server Page)服務器腳本語言和ACCESS數(shù)據(jù)庫，實現(xiàn)了牙周臨床指標數(shù)據(jù)錄入統(tǒng)計和牙周健康狀況全景形象展示，較為全面細致地反映患者牙周狀況，可以滿足牙周?？坪捅菊n題臨床病例牙周指數(shù)統(tǒng)計的需要，為發(fā)展國內(nèi)牙周?？齐娮硬v做出有益探索。

8、 第二部分MMP-2，MMP-9和TIMP-2啟動子區(qū)基因多態(tài)性與侵襲性牙周炎相關(guān)性研究 研究樣本為79名廣泛型侵襲性牙周炎(generalized aggressive periodontitis，G-AgP)患者和128名臨床牙周健康對照者；本研究樣本的檢驗效能為75％，樣本量大小符合檢測效能的要求。Chelex-100法從頰拭子脫落細胞中提取DNA，采用聚合酶鏈反應-變性高效液相色譜法（denaturing high- p

9、erformance liquid chromatography，DHPLC）和限制性片段長度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)法分別檢測樣本MMP-2-1306bpC/T，MMP-9-1562 C/T和TIMP-2-418G/C啟動子區(qū)基因多態(tài)性；分析兩組中基因型分布、等位基因頻率，以及MMP-2和TIMP-2復合基因單體型。 結(jié)果：Chelex-100法

10、所提取DNA完全可以滿足本實驗候選基因的SNP檢測；G-AgP組和對照組按照年齡和性別t檢驗p = 0.157和0.124，兩組的性別、年齡匹配。經(jīng)卡方檢驗兩組中MMP-2，-9，和TIMP-2基因型符合哈代-溫伯格平衡（Hardy-Wenberg equilibrium）(2χ= 0.001~0.83,p>0.05)。卡方檢驗均經(jīng)過耶茨校正(Yates’ correction)，多重卡方檢驗校正p＜0.017為有顯著性意義。MMP-2

11、-1306C/T、MMP-9-1562C/T啟動子區(qū)基因多態(tài)性在G-AgP組和對照組中最常見的基因型為CC，而TT基因型少見，各基因型在兩組的分布沒有差異(p＞0.05)。等位基因頻率在兩組中也沒有顯著性差異(p=0.707，0.858)。TIMP-2啟動子區(qū)基因多態(tài)性在G-AgP組和對照組中基因型和等位基因頻率的分布：在G-AgP組GC+CC基因型（48.1％）比對照組（32.0％）明顯增多[p = 0.030; OR: 1.97,

12、95％ CI: (1.11;3.50)]，這種差異經(jīng)過多重卡方檢驗校正后失去顯著性意義(p＞0.017)；TIMP-2-418G和-418C等位基因頻率在G-AgP組分別為71.5％和28.5％，而在對照組分別為82.4％和17.6％，等位基因-418C在G-AgP組的檢出頻率顯著高于對照組[p=0.013; OR: 1.87, 95％ CI: (1.17;2.99)]。MMP-2和TIMP-2 復合基因單體型分析以常見的MMP-2-1

13、306CC+TIMP-2-418GG基因型作參照，兩組中復合基因型分布差異沒有顯著性意義(p＞0.05)，即沒有顯示出MMP-2和TIMP-2復合基因的疊加作用和我國漢族人群侵襲性牙周炎有相關(guān)性。 結(jié)論：MMP-2-1306C/T、MMP-9-1562C/T啟動子區(qū)基因多態(tài)性可能不是我國漢族人群侵襲性牙周炎的遺傳易感因素；TIMP-2-418G/C啟動子區(qū)基因多態(tài)性與我國漢族人群廣泛型侵襲性牙周炎有相關(guān)性，TIMP-2-418

14、C等位基因可能是我國漢族人群廣泛型侵襲性牙周炎的遺傳易感因素。 第三部分MMP-9, TIMP-2在不同基因型侵襲性牙周炎患者牙齦組織中的表達 本部分對6例健康牙齦標本和9例AgP患者牙齦標本，應用免疫組織化學染色法，按照MMP-9-1562bpC/T、TIMP-2-418G/C不同基因型分組，觀察牙齦組織中MMP-9、TIMP-2的表達，目的在于分析MMP-9、TIMP-2在侵襲性牙周炎不同基因型的齦組織表達情況。

15、 結(jié)果：在正常牙齦標本中MMP-9和TIMP-2幾乎不表達，而在侵襲性牙周炎患者的牙齦組織中MMP-9和TIMP-2表達明顯。MMP-9主要在固有層炎性細胞密集區(qū)陽性表達；TIMP-2多在上皮層表達。在病例組，含有MMP-9-1562T等位基因和不含MMP-9-1562T等位基因的牙齦組織中MMP-9表達陽性細胞數(shù)量和平均灰度值無顯著差別；不含TIMP-2-418C等位基因的牙齦組織中TIMP-2表達陽性細胞平均灰度值雖然高于含有