1、中草藥在中國具有悠久的應(yīng)用歷史，是中國勞動(dòng)人民千百年來智慧的結(jié)晶，從中草藥中尋找具有現(xiàn)代藥理活性的化合物或先導(dǎo)化合物，不僅會(huì)起到事半功倍的作用，而且也切實(shí)可行的。 在篩選來自植物的抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛活性成分的過程中，本研究室采集了數(shù)百種藥用植物，在現(xiàn)代藥理模型的配合下綜合評(píng)價(jià)了這些藥用植物。結(jié)果篩選出綜合優(yōu)勢的藥用植物供進(jìn)一步研究，本課題選擇了短瓣金蓮花、巴豆葉作為研究對(duì)象，在活性的指導(dǎo)下，依靠現(xiàn)代植物化學(xué)的手段，尋找出兩種藥用植

2、物中的主要活性成分，并初步建立其質(zhì)量分析方法，為其進(jìn)一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。 1.短瓣金蓮花化學(xué)成分及抗炎活性研究短瓣金蓮花(TrolliusledebouriReichb)，系金蓮花屬短瓣金蓮花的花，《中藥大詞典》記載短瓣金蓮花對(duì)風(fēng)濕、慢性扁桃體炎、急性中耳炎等癥有效。文獻(xiàn)報(bào)道金蓮花中的黃酮碳苷類化合物可能是其潛在的活性成分之一，因此著重對(duì)該類化合物進(jìn)行追蹤分離，并采用巴豆油誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹模型、COX2酶模型、二倍稀釋法對(duì)其提取部

3、位、分離到單體化合物進(jìn)行了抗炎、抗菌活性評(píng)價(jià)。 將短瓣金蓮花用60％乙醇提取，60％乙醇浸膏經(jīng)過不同極性的溶劑劃分成四個(gè)部位：石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位，各部位運(yùn)用硅膠柱層析、聚酰胺柱層析、大孔樹脂柱層析、凝膠柱層析、反相柱層析等植物化學(xué)手段，分別富集到黃酮類化合物、苯乙素類化合物，確立了短瓣金蓮花中抗炎、抗菌活性成分的分離策略。從短瓣金蓮花中分離得到包括黃酮類、萜類、香豆素類、苯乙素類、有機(jī)酸類、氨基酸類等4

4、0個(gè)單體化合物。經(jīng)過經(jīng)典的化學(xué)方法和各種現(xiàn)代波譜學(xué)技術(shù)(包括IR、UV、ORD，1H-NMR，13C-NMR，DEPT,1H-1HCOSY,HMQC，HMBC，NOESYEI-MS，ESI-MS，HRMS)對(duì)它們中的30個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。其中6個(gè)新化合物，1個(gè)新的天然產(chǎn)物，15個(gè)為該屬中首次分離得到。并且首次利用GC-MS分析了短瓣金蓮花中的揮發(fā)油成分，結(jié)果表明其主要含有脂肪類化合物。 新化合物為黃酮碳苷類化合物，分別命

5、名為7-甲氧基-2"-O-(2'"-甲基丁?；?葒草苷、7-甲氧基-2"-O-(2′"-甲基丁?；?6′"-甲?；?牡荊苷；苯乙素類化合物，分別命名為2-(3-O-葡萄糖-4甲氧基苯基)乙醇、2-(3-羥基-4-甲氧基-苯基)乙醇葡萄糖苷、2-(3,4-二甲氧基-苯基)乙醇葡萄糖苷；新香豆素類化合物命名為6-O-鼠李糖-8-O-葡萄糖香豆素；及新的苯乙素類天然產(chǎn)物2-(4-羥基-苯基)乙醇葡萄糖苷。首次從該屬中分離得到已知化合物包括黃酮

6、類化合物：木犀草素、芹菜素、槲皮素、6′"-O-葡萄糖葒草苷、6′"-O-葡萄糖牡荊苷、4'-甲氧基-7-O-葡萄糖鼠李糖芹菜素、3'，4'-O-亞甲基葒草苷；苯乙素類化合物：2-(3,4-二羥基-苯基)乙醇葡萄糖苷、2-(4-羥基-3-O-葡萄糖基苯基)乙醇、2-苯基乙醇葡萄糖苷、2-(4-羥基-苯基)乙醇葡萄糖苷；氨基酸化合物：脯氨酸、苯丙氨酸；香豆素類化合物：5-O-鼠李糖香豆素；及豆甾醇；有機(jī)酸類化合物：黎蘆酸為首次從該植物中分

7、離得到；及其他已知化合物為：牡荊苷、葒草苷、7-甲氧基-2"-O-(2′"-甲基丁?；?牡荊苷、2"-O-(3′"，4′"-二甲基苯甲酰基)牡荊苷、2"-O-(3′"，4′"-二甲基苯甲?；?葒草苷、2"-O-(2′"-甲基丁?；?牡荊苷、2"-O-(2′"-甲基丁?；?葒草苷、β-谷甾醇。 經(jīng)過前期的初步藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明短瓣金蓮花表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎活性及一定的抗菌活性，繼而我們希望結(jié)合藥理評(píng)價(jià)模型尋找到短瓣金蓮花中抗炎、抗菌活性成

8、分。在巴豆油誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹模型上評(píng)價(jià)了短瓣金蓮花60％乙醇浸膏、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位的抗炎活性，結(jié)果表明在灌胃和腹腔注射給藥方式下，總浸膏及各部位均表現(xiàn)出一定的抗炎活性。尤其乙酸乙酯部位、正丁醇部位抑制巴豆油誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹率達(dá)到60％左右，這兩個(gè)部位含有豐富的黃酮類化合物。繼而我們對(duì)這兩部位中分離得到的主要黃酮類化合物進(jìn)行了TPA誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹模型及對(duì)COX2酶抑制活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果證明黃酮類單體化合物是

9、其主要的抗炎活性成分，尤其雙糖黃酮化合物不僅能較強(qiáng)的抑制TPA誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹，也能有效抑制COX2酶活性。其抑制巴豆油誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹抑制率達(dá)到70％左右。為了進(jìn)一步證明黃酮碳苷類化合物對(duì)COX2的抑制作用的特異性，實(shí)驗(yàn)中以短瓣金蓮花60％乙醇浸膏直接與COX2共同孕育，利用超濾法分離和HPLC-DAD法分析，結(jié)果表明與COX2結(jié)合的物質(zhì)也是黃酮碳苷，與單體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。首次明確了短瓣金蓮花中抗炎活性成分，且第一次報(bào)道了黃酮碳苷類化

10、合物的抗炎作用，且其作用機(jī)制可能與COX2酶有關(guān)。 實(shí)驗(yàn)中以黃酮類化合物為主要活性成分建立了短瓣金蓮花的定性和定量的分析方法，其HPLC分析條件為：甲醇：水(30：70)，40min升到甲醇：水(70：30)，紫外檢測波長為335nm。尤其以活性較好的雙糖黃酮化合物11、化合物12為質(zhì)量指標(biāo)，建立了短瓣金蓮花的初步HPLC分析方法，兩個(gè)單體的標(biāo)準(zhǔn)曲線分另為：y=109.46x+19.634(r=0.9958)和y=217.96x

11、+19.098(r=0.9949)；最小檢測極限為：4.5ng和9.1ng；該方法重現(xiàn)性好，操作簡單，靈敏度較高。較文獻(xiàn)中運(yùn)用葒草苷、牡荊苷作為質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)更確切，可行。為進(jìn)一步對(duì)短瓣金蓮花研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。 短瓣金蓮花還表現(xiàn)出一定的抗菌活性，文獻(xiàn)報(bào)道黃酮碳苷類成分是其抗菌物質(zhì)基礎(chǔ)，但在我們評(píng)價(jià)黃酮類成分抗菌活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，黃酮碳苷未表現(xiàn)出抗菌活性，而是從金蓮花屬首次分離得到的苯乙素類化合物表現(xiàn)出一定的抗菌活性，尤其化合物14對(duì)金黃色

12、葡萄球菌表現(xiàn)出較好的抗菌活性，其MIC為64ug/ml。而對(duì)其他供試病菌沒有抑制作用。同時(shí)實(shí)驗(yàn)中考察了短瓣金蓮花對(duì)耐藥菌株的抑制作用及與西藥的協(xié)同作用，結(jié)果表明短瓣金蓮花不能增加耐藥菌株的敏感性。本研究首次發(fā)現(xiàn)了金蓮花屬中的苯乙素類化合物，并明確其為短瓣金蓮花中的抗菌活性成分之一。 另外通過運(yùn)用ESIMS-MS技術(shù)對(duì)分離得到的黃酮碳苷的質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行了初步研究，負(fù)離子掃描出現(xiàn)[M-1]及[M+Cl]的準(zhǔn)分子離子峰，正離子掃描出

13、現(xiàn)[M+H]、[M+Na]、[M+K]準(zhǔn)分離離子峰，負(fù)離子進(jìn)行二級(jí)譜掃描，結(jié)果表明黃酮碳苷類化合物常出現(xiàn)[M-H-60]、[M-H-90]、[M-H-120]等碎片離子峰。并運(yùn)用該規(guī)律分析了短瓣金蓮花中可能存在的其他微量黃酮碳苷類化合物，結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)其他的黃酮碳苷類化合物存在，如7-甲氧基-2"-O-(2′"-甲?；?牡荊苷。 2.巴豆葉化學(xué)成分及鎮(zhèn)痛活性評(píng)價(jià)巴豆葉系大戟科巴豆屬植物巴豆(CrotontigliumL.)的葉，《

14、中國植物志》記載巴豆有作峻瀉藥、祛風(fēng)截瘧、活血?dú)⑾x等功效。文獻(xiàn)報(bào)道該屬中含有大量的二萜類化合物，其中巴豆果實(shí)中提取的混合二萜類成分具有致癌作用和毒性。我們在對(duì)鎮(zhèn)痛活性中草藥的篩選過程中首次發(fā)現(xiàn)了巴豆葉具有較好的鎮(zhèn)痛作用，本實(shí)驗(yàn)旨在以活性指導(dǎo)(醋酸扭體模型、熱板模型)追蹤分離巴豆葉中鎮(zhèn)痛活性成分。 新鮮巴豆葉晾干后，以95％乙醇提取，乙醇浸膏利用不同極性溶劑劃分為3部分：石油醚部位、乙酸乙酯部位、水部位。在活性指導(dǎo)下，我們對(duì)乙酸乙

15、酯部位、水部位運(yùn)用硅膠柱層析、大孔樹脂柱層析、凝膠柱層析、半制備性反相柱層析等植物化學(xué)手段，我們分離得到甾體、萜類、生物堿類化合物15個(gè)，并利用常規(guī)理化性質(zhì)及現(xiàn)代波譜技術(shù)鑒定了9個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，其中3個(gè)新化合物，其命名分別為2-(furan-2-yl)-5-(2,3,4-trihydroxy-butyl)-1,4-diazine、2-((2-methoxypyridin-5-yl)methyl)hex-4-3n-3-one、Tigliu

16、mC；其他分離到的化合物均首次從巴豆葉中分離得到，即β-谷甾醇、豆甾體、二十二烷醇、24-ethyl,5,22-cholest-dien-3α-ol，12-O-(2-methyl)butyrylphorbol-13-acetate,12-O-Tigloylphorbol-13-(2-methylpropyrate),12-O-Tigloylphorbol-13-(2-methylbutyrate)等；同時(shí)也對(duì)巴豆葉中揮發(fā)油成分進(jìn)行了GC

17、-MS分析，結(jié)果表明其主要是脂肪類化合物。 在化學(xué)工作的基礎(chǔ)上，我們對(duì)巴豆葉鎮(zhèn)痛活性進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在灌胃給藥、腹腔注射給藥方式下，在醋酸誘導(dǎo)的小鼠扭體反應(yīng)模型上評(píng)價(jià)了巴豆葉乙醇浸膏、石油醚部位、乙酸乙酯部位、水部位的鎮(zhèn)痛活性，結(jié)果表明各部位都表現(xiàn)出一定的鎮(zhèn)痛活性，尤其乙酸乙酯部位是其主要的活性部位，其EC50為1.94mg/kg，并在熱板模型上也表現(xiàn)出顯著延長小鼠的疼痛閾值，在50-200mg/kg的劑量下，延長小鼠