1、目的：①研究中國風濕性疾病患者群中MDR1C3435T、RFC1 G80A、GGH C—401T、FPGS(rs1544105)G>A、MTHFR C677T和MTHFR A1298C基因型的分布，并與其他種族進行比較，明確種族差異。②建立LC/MS/MS分析法測定人血紅細胞中甲氨蝶呤谷氨酸聚合物濃度。③分析紅細胞內(nèi)MTXPGs濃度和MTX治療風濕性疾病療效、不良反應間的相關(guān)性，探討MTX轉(zhuǎn)運代謝作用通路上的MDR1C3435T、RFC

2、1 G80A、GGH C—401T、FPGS(rs1544105)G>A、MTHFR C677T和MTHFR A1298C基因多態(tài)性對紅細胞內(nèi)MTXPGs濃度和對MTX治療風濕性疾病療效及不良反應的影響。 方法：⑴用PCR—RFLP的方法檢測分析MDR13435、RFC180、GGH—401、FPGS(rs1544105)、MTHFR677和MTHFR1298五個基因6個位點在中國風濕患者群中的分布情況，并驗證是否符合Hardy

3、—Weinberg平衡，同時和其他種族基因突變頻率與等位基因頻率的分布進行比較。⑵采用液質(zhì)聯(lián)用電噴霧檢測法(LC/MS/MS)。全血經(jīng)VitaminC37℃孵育3h得到甲氨蝶呤總濃度，不經(jīng)Vitamin C孵育處理的即為原型甲氨蝶呤濃度，全血甲氨蝶呤谷氨酸聚合物濃度=總甲氨蝶呤濃度—原型甲氨蝶呤濃度。再根據(jù)體積比換算為紅細胞內(nèi)甲氨蝶呤谷氨酸聚合物的濃度。提取方法用液液萃取的方法，先用三氟乙酸蛋白沉淀，再用乙酸乙酯提取。樣品經(jīng)電噴霧離子源

4、正離子化后，通過三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，采用多反應監(jiān)測(MRM)對甲氨蝶呤(m/z455.2→308.2)和內(nèi)標多索茶堿(m/z267.2→181.2)進行測定。色譜柱為Ultimate XB—C18柱，流動相為乙腈(1％甲酸)/甲酸銨水溶液(20 mM)＝30:70，流速為0.2mL/min，柱溫為25℃，每個樣品的分析時間為3min。⑶用PCR—RFLP法檢測MDR1、RFC1、GGH、FPGS和MTHFR基因多態(tài)性，用LC/MS/M

5、S法檢測紅細胞內(nèi)MTXPGs濃度，用Phase2.1軟件分析MTHFR單倍型。用x2檢驗、非參數(shù)檢驗、多重線性回歸、Logistic回歸等分析方法分析各個評價指標間的相關(guān)性。 結(jié)果：①6個位點等位基因頻率如下：MDR13435C64％，MDR13435T36％；RFC180G51％,RFC180A49％；GGH—401C81％,GGH—401T19％；FPGS(rs1544105)G26％, FPGS(rs1544105)A74

6、％；MTHFR677C73％, MTHFR677T27％；MTHFR1298A79％，MTHFR1298C21％。各個基因型都符合Hardy—Weinberg平衡。②MTX血藥濃度在1～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2均大于0.99)，分析方法的最低檢測限為0.5 ng/mL。其高、中、低(50、10、2 ng/mL)3種濃度在全血及孵育全血中的平均提取回收率在26.2％～37.8％之間，方法回收率在99.1％-108.4％之

7、間。日內(nèi)(n=5)、日間(n=3)精密度RSD均<15％。各項穩(wěn)定性考察符合FDA的有關(guān)要求。③紅細胞內(nèi)MTXPGs濃度和RA患者療效存在相關(guān)性，濃度大于25 nmol/L患者療效較好。④RFC180和GGH—401位突變對胞內(nèi)MTXPGs濃度的影響有統(tǒng)計學意義，RFC180純合型和GGH—401野生型個體胞內(nèi)MTXPGs水平較高。⑤RA患者：單因素分析MTX療程對VASb、HAQb和TJCb都有顯著影響，用藥持續(xù)時間越長，療效越好。M

8、DR1、GGH分別與VASb和TJCb有相關(guān)性，攜帶MDR13435純合型個體療效較好，GGH—401野生型個體療效好。MDR13435純合型分布在療效好組明顯比療效差組多。經(jīng)多重線性回歸和Logistic回歸分析，再次驗證用藥持續(xù)時間、RFC1、GGH對療效各個評價指標有貢獻，影響大小不一。⑥ AS患者：單因素分析只得到年齡對療效有影響，年齡越大，療效越差；MDR13435純合型在療效好組分布頻率高。經(jīng)多重線性回歸分析，也只有年齡和M

9、DR1基因型對療效的差異有貢獻。經(jīng)Logistic回歸分析，MTHFR1298純合型個體療效較好。⑦對不良反應的分析發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T與不良反應的相關(guān)有統(tǒng)計學意義，突變型在不良反應組分布頻率較高，提示MTHFR677突變型可能是不良反應的危險因素。攜帶677T-1298A單倍型個體更容易發(fā)生不良反應。 結(jié)論：⑴除了MTHFR677的突變頻率較低外，本研究風濕患者群中的各基因頻率與已報道的北京健康志愿者基因頻率相似。各基

10、因頻率與其他種族間存在種族差異。⑵本方法簡單、快速、靈敏、準確、重現(xiàn)性好，可用于MTX的臨床血藥濃度監(jiān)測、藥動學研究。⑶紅細胞內(nèi)MTXPGs濃度和RA患者療效存在相關(guān)性，濃度大于25 nmol/L患者療效較好。RFC180G>A及GGH—401C>T對胞內(nèi)MTXPGs濃度、RA患者療效的影響有統(tǒng)計學差異，RFC180純合型個體和GGH—401野生型個體胞內(nèi)MTXPGs水平較高，療效較好。MDR13435純合型個體療效較好。RFC180、