1、本文主要從以下幾方面進行闡述：
　　第一部分 脯氨酰羥化酶3在糖尿病性心肌病心功能異常的作用及機制研究
　　研究目的：
　　1.研究心肌組織中PHD3對糖尿病性心肌病大鼠心臟重構(gòu)和心功能損傷的影響。
　　2.研究心肌組織中PHD3對糖尿病性心肌病大鼠心肌細(xì)胞凋亡和心肌間質(zhì)纖維化的影響。
　　研究方法：
　　1.大鼠糖尿病性心肌病模型的建立
　　60只雄性Sprague-Dawley大鼠(100-

2、120 g)隨機分為四組（每組n=15）:control組;糖尿病組（DM組）;糖尿病+PHD3-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染組（DM+shPHD3組）;糖尿病+慢病毒空載體轉(zhuǎn)染組（DM+shN.C組）。Control組給予正常飲食，其余3組給予高脂飲食。4周后，所有大鼠行腹腔葡萄糖耐量實驗(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)和腹腔胰島素耐量試驗(intraperitoneal insul

3、in tolerance test，IPITT)。成功誘導(dǎo)胰島素抵抗的大鼠腹腔注射35mg/kg的鏈脲菌素(streptozotocin，STZ)。STZ注射1周后檢測空腹血糖，隨機兩次空腹血糖≥11.1mmol/L認(rèn)為2型糖尿病造模成功。成功誘導(dǎo)2型糖尿病的大鼠繼續(xù)給予高脂飲食喂養(yǎng)，至STZ注射后第8周行大鼠心功能檢測，若出現(xiàn)左室舒張功能障礙則提示糖尿病大鼠開始向糖尿病性心肌病進展，此時可對其進行PHD3慢病毒及空載體慢病毒體內(nèi)干預(yù)。

4、
　　2.PHD3-shRNA慢病毒載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染
　　設(shè)計3對針對大鼠PHD3基因的shRNA質(zhì)粒，篩選后選擇沉默效率最高的序列構(gòu)建含有綠色熒光蛋白(GFP)報告基因的慢病毒載體。PHD3的干擾序列為5'-GGGCAAATACTATGTCAAG-3'，空載體序列為5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。STZ注射8周后，頸靜脈注射PHD3-shRNA慢病毒和空載體慢病毒，4周后取材，制備冰凍切片檢測病毒轉(zhuǎn)染效率

5、。
　　3.超聲心動圖檢測大鼠左室功能
　　采用二維、M超、脈沖和組織多普勒技術(shù)評價大鼠左室功能。
　　4.組織學(xué)染色
　　心臟取材后稱重，測量心臟大小，留取心臟大體照片。甲醛固定后，在左室乳頭肌水平橫切并制備石蠟切片，應(yīng)用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosinstaining，H&E)染色、Masson染色、天狼猩紅染色檢測心臟的大體形態(tài)結(jié)構(gòu)和心肌膠原含量。應(yīng)用免疫組化染色檢測心肌組織PHD3、膠原Ⅰ

6、、膠原Ⅲ的分布和表達情況。
　　5.Tunel檢測
　　應(yīng)用Tunel檢測大鼠心肌組織中細(xì)胞凋亡的情況。
　　6.明膠酶譜
　　應(yīng)用明膠酶譜法檢測心肌組織MMP-2和MMP-9的活性。
　　7.蛋白印跡分析
　　提取大鼠心肌組織蛋白，檢測PHD3、cleaved caspase-3、膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、MMP-2、MMP-9的蛋白表達水平。
　　8.統(tǒng)計學(xué)分析
　　各組實驗至少獨立重復(fù)三遍。應(yīng)

7、用SPSS18.0軟件分析處理數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。p＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　1.高脂飲食4周成功誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗
　　大鼠正常和高脂飲食4周后行IPGTT和IPITT檢測。結(jié)果顯示，與對照組大鼠相比，高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠在0 min、15 min、30 min、60 min、120 min時血糖值顯著升高，血糖曲線下面積(the area under the curve

8、，AUC)顯著增加。
　　2.PHD3在糖尿病大鼠心肌組織中表達增高
　　與對照組大鼠相比，糖尿病組大鼠心肌組織PHD3的蛋白表達水平顯著增加。與糖尿病組大鼠相比，PHD3-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染組大鼠PHD3蛋白水平明顯降低，基因干預(yù)可以有效抑制心肌組織PHD3的表達。
　　3.PHD3基因沉默改善糖尿病引起的左室重構(gòu)
　　與正常組大鼠相比，糖尿病大鼠心臟明顯增大，心身比值明顯增加;左室乳頭肌切面HE染色顯示，糖

9、尿病大鼠左室呈向心性肥厚;心肌橫切面HE染色顯示心肌細(xì)胞直徑顯著增加。抑制PHD3可明顯改善糖尿病引起的上述心臟結(jié)構(gòu)和形態(tài)的變化。
　　4.PHD3基因沉默改善糖尿病引起的心功能損害
　　與正常組大鼠相比，糖尿病組大鼠心功能損害主要表現(xiàn)為舒張功能異常同時伴有收縮功能下降，表現(xiàn)為E/A、E'/A'、LVEF、FS值降低，LVEDd值增加。PHD3基因沉默顯著改善上述心功能異常。
　　5.抑制PHD3明顯改善糖尿病大鼠的心

10、肌凋亡程度
　　Tunel染色顯示糖尿病大鼠心肌細(xì)胞的凋亡程度較正常大鼠明顯增加。Western blot檢測顯示心肌組織cleaved caspase-3的表達水平顯著增高。抑制PHD3明顯降低糖尿病大鼠心肌細(xì)胞的凋亡程度和cleaved capase-3的蛋白表達水平。
　　6.抑制PHD3明顯改善糖尿病大鼠的心肌纖維化程度
　　Masson和天狼猩紅染色顯示，與正常大鼠相比，糖尿病大鼠心肌間質(zhì)膠原沉積明顯增加。免

11、疫組織化學(xué)和western blot檢測顯示心肌組織膠原Ⅰ、膠原Ⅲ表達水平顯著增高。抑制PHD3顯著降低心肌間質(zhì)膠原沉積和膠原Ⅰ、膠原Ⅲ的表達水平。
　　7.抑制PHD3減少心肌組織MMP2、MMP-9的表達
　　與正常大鼠相比，糖尿病大鼠心肌細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達水平明顯增高。抑制PHD3后MMP-2、MMP-9蛋白表達水平降低。明膠酶譜檢測顯示糖尿病大鼠心肌細(xì)胞MMP-2活性增加，抑制PHD3后活性降低。

12、r>　　研究結(jié)論：
　　1.PHD3在糖尿病大鼠心肌組織中表達增加;
　　2.應(yīng)用PHD3-shRNA慢病毒體內(nèi)干預(yù)后，心肌組織PHD3的蛋白表達水平被有效抑制;
　　3.抑制心肌組織PHD3的表達可改善糖尿病大鼠的心臟重構(gòu)和心功能損害;
　　4.抑制PHD3后糖尿病大鼠心功能損害的減輕主要與其降低心肌凋亡和纖維化有關(guān)。
　　第二部分 脯氨酰羥化酶3在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中的作用及機制研究
　　研究

13、目的：
　　1.研究高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞PHD3表達增加的機制。
　　2.研究PHD3對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響。
　　3.探討PHD3介導(dǎo)高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞凋亡的信號分子機制。
　　研究方法：
　　大鼠H9c2心肌細(xì)胞系:購自美國American Type Cell Collection公司。原代心肌細(xì)胞:由2-3天的大乳鼠左室組織提取。并進行適當(dāng)培養(yǎng).設(shè)計3對針對PHD3基因的siRNA表達載體，經(jīng)篩選后

14、選擇沉默效率最高的PHD3-siRNA抑制H9c2心肌細(xì)胞PHD3的基因表達。應(yīng)用免疫熒光染色法檢測H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)PHD3的含量和分布。并使用DCFH-DA探針檢測高糖誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞生成ROS的熒光強度，以及應(yīng)用細(xì)胞ROS清除劑NAC后ROS的熒光強度。同時，檢測各組H9c2心肌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡程度，計算細(xì)胞凋亡率。提取各組細(xì)胞蛋白，檢測PHD3、cleaved caspase-3、HIF-1α、ERK、p-ERK、JNK、p-

15、JNK、p38、p-p38的蛋白水平。應(yīng)用SPSS18.0軟件分析處理數(shù)據(jù)，并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，p＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　研究結(jié)果：
　　1.在H9c2心肌細(xì)胞系和原代心肌細(xì)胞中，高糖均誘導(dǎo)PHD3表達增加。
　　應(yīng)用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2細(xì)胞和原代心肌細(xì)胞6h，12h，24 h，48h，PHD3的蛋白表達水平逐漸增加，具有時間依賴性。免疫熒光檢測顯示，PHD3大量定位于胞漿，少量定位于胞核。
　　2

16、.ROS介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的PHD3表達上調(diào)。
　　高糖刺激H9c2細(xì)胞6h，12h，24 h，48 h，ROS的生成增加，具有時間依賴性。應(yīng)用細(xì)胞ROS清除劑NAC后，ROS的表達明顯減少，同時PHD3的蛋白表達水平顯著降低。
　　3.抑制PHD3減少高糖引起的心肌細(xì)胞凋亡。
　　應(yīng)用PHD3-siRNA轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞抑制PHD3表達，檢測PHD3對細(xì)胞凋亡的影響。Western blot及Tunel檢測結(jié)果顯示，高糖能

17、增加H9c2細(xì)胞凋亡，而抑制PHD3可降低高糖誘導(dǎo)增加的cleaved caspase-3水平及細(xì)胞凋亡率。
　　4.在高糖環(huán)境下，PHD3的作用與HIF-1α無關(guān)
　　應(yīng)用高糖刺激原代心肌細(xì)胞6h，12h，24 h，48 h，HIF-1α的表達水平無明顯變化，應(yīng)用PHD3 siRNA抑制H9c2細(xì)胞PHD3的表達后，HIF-1α的表達仍未有改變。
　　5.抑制PHD3降低高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞MAPK磷酸化水平。

18、　　Western blot檢測H9c2細(xì)胞中p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38及p38水平，結(jié)果顯示抑制PHD3能夠顯著降低高糖誘導(dǎo)的ERK及JNK的磷酸化水平的上調(diào)，而對p38的磷酸化水平無影響。
　　研究結(jié)論：
　　1.ROS介導(dǎo)了高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞PHD3表達上調(diào)。
　　2.抑制PHD3減少高糖引起的心肌細(xì)胞凋亡。
　　3.抑制PHD3減少心肌細(xì)胞凋亡的作用是通過阻斷MAPKs信號通路實現(xiàn)