1、流感病毒是嚴重危害人類的呼吸道傳染病原體,曾多次引起世界流感大流行。它是單鏈負鏈RNA病毒,其基因由8段RNA組成編碼11種蛋白:血凝素HA,神經(jīng)氨酸酶NA,基質(zhì)蛋白M1,離子通道蛋白M2,非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2,核蛋白(nucleoprotein,NP),凋亡前體蛋白PB1-F2和RNA依賴性RNA聚合酶PA,PB1和PB2等。核蛋白NP為流感病毒顆粒的重要組成部分,由498個氨基酸組成分子質(zhì)量約56 KD的多肽,是甲型流感病毒RN

2、A的第5節(jié)段基因編碼的RNA結(jié)合蛋白,與多聚酶蛋白及病毒單鏈的RNA相互作用形成螺旋對稱的RNP復合體。RNP復合體,與依賴RNA的多聚酶一起成為病毒基因組復制與轉(zhuǎn)錄必不可少的結(jié)構(gòu)。NP也是細胞毒性T淋巴細胞識別的主要抗原。所以甲型流感病毒核蛋白基因可以作為防治流感病毒的一個主要靶點.
　　 目的:
　　 本實驗通過構(gòu)建甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)核蛋白基因的真核表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染Hela細胞,并檢測Hela細

3、胞內(nèi)NP的表達情況,為進一步研究核蛋白的功能和相關(guān)理化作用及對核蛋白的影響奠定基礎。
　　 方法：
　　 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫已發(fā)表的甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)(GenBank/NCB,GI:8486129)毒株的核蛋白基因全長序列用Primer Primier5軟件設計兩條NP的特異引物并加酶切點,用特異引物從甲型流感病毒cDNA中采用PCR技術(shù)克隆出NP基因,酶切后,將其插入到真核表達質(zhì)粒pcDNA3.

4、1(+)。構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/N P經(jīng)酶切、PCR、測序鑒定。將構(gòu)建好的pcDNA3.1(+)/N P用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染Hela細胞,用甲型流感病毒檢測試劑盒(Flu A Rapid Test Kit)檢測檢測Hela細胞內(nèi)外NP的表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 經(jīng)PCR克隆出的甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)NP基因,經(jīng)酶切連接后構(gòu)建一個新的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/N P,該質(zhì)粒經(jīng)

5、酶切、PCR、測序鑒定均表明成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)/N P。構(gòu)建的質(zhì)粒含一個核苷酸長度為1432bp的基因,和A/PR/8/34(H1N1)(GenBank/NCB,GI:8486129)有98％的同源性。
　　 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞后用甲型流感病毒檢測試劑盒檢測到24h、48h、72h細胞內(nèi)外NP的蛋白表達。
　　 結(jié)論：
　　 成功構(gòu)建甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)核蛋白基因的真核表