1、藥物研發(fā)是一個非常耗費時間、人力和物力的過程,雖然很多先導候選藥物在體外有很好的藥理活性,但當它們進入動物或者臨床試驗的時候,都表現(xiàn)出很低的生物活性,甚至出現(xiàn)了一些顯著的副作用,因此大多數(shù)新候選藥物都在臨床試驗中被淘汰。體外與體內(nèi)藥物代謝的微環(huán)境之間存在的差異,很有可能是導致化合物在體外表現(xiàn)出很好的效果、而在體內(nèi)卻沒有顯著效果的重要原因。
　　基于此,本課題建立了一種可以模擬血管微環(huán)境的藥物篩選模型,以提高藥物篩選的效率。血管發(fā)生

2、病變的部位,血管壁主要受到低剪切力或震蕩剪切力的作用,而血管壁的平滑肌可與內(nèi)皮細胞形成血管肌-內(nèi)皮縫隙連接,實現(xiàn)電信號和小分子物質(zhì)的相互傳遞,對血管的生理和病理狀態(tài)有重要的影響。因此為了模擬血管病變部位的微環(huán)境,我們設計和建立了一種可以提供低剪切力,并且能實現(xiàn)內(nèi)皮和平滑肌細胞聯(lián)合培養(yǎng)的流動腔。首先,對流動腔進行了流體數(shù)值模擬分析。然后,建立了模擬血管微環(huán)境的藥物篩選模型,并選擇內(nèi)皮細胞的形態(tài)指數(shù)和凋亡率、血小板衍生生長因子、超氧化物歧化

3、酶、丙二醛、平滑肌細胞的遷移率作為驗證模型有效性的指標,選擇臨床藥物曲匹地爾和丹參作為模型藥物。最后,利用該模型對丹參提取物中,具有抗血管疾病的活性物質(zhì)進行了篩選,通過與傳統(tǒng)的藥物篩選模型進行對比,更進一步驗證了我們所建立的藥物篩選模型的有效性,并且由于該模型在體外模擬了血管的微環(huán)境,因此有助于提高藥物篩選的效率,具有為藥物研發(fā)節(jié)約時間和成本的潛在優(yōu)勢。
　　本課題的主要研究內(nèi)容和相應結(jié)果如下:
　?、僭O計了一種可以提供低剪

4、切力,并能滿足細胞聯(lián)合培養(yǎng)的流動腔,作為模擬血管微環(huán)境的載體。利用Fluent6.3軟件對不同長度的流動腔(100mm、90mm、80mm、70mm和60mm)內(nèi)部的流體狀態(tài)進行了數(shù)值模擬。結(jié)果表明,隨著流動腔長度逐漸縮短,細胞培養(yǎng)區(qū)域流體的速度和剪切力波動逐漸增大。當流動腔長度為70mm時,剪切力大小在4dyn/cm2-6.5dyn/cm2范圍內(nèi),細胞培養(yǎng)區(qū)域的剪切力出現(xiàn)了兩個峰值,這可能是通道中再循環(huán)渦流處的高流速梯度導致。因此,為

5、了在體外模擬振蕩低剪切力的情況,我們選擇70mm的流動腔長度進行后期的實驗。
　?、诮⒘四M血管微環(huán)境的藥物篩選模型,該模型由流動腔、恒流泵和儲液瓶構(gòu)成。流動腔可以為內(nèi)皮細胞提供一個與血管損傷部位相似的低剪切力,流動腔內(nèi)聯(lián)合培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞通過半透膜進行物質(zhì)和信息的傳遞,該模型很好地模擬了體內(nèi)血管的微環(huán)境?？疾炝瞬煌笮〉募羟辛?1dyn/cm2、2dyn/cm2、4dyn/cm2、6dyn/cm2、8dyn/cm2和

6、10dyn/cm2)和作用時間(6h、12h和24h)對內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞活性的影響。結(jié)果表明,當剪切力為4dyn/cm2且作用了12h后,內(nèi)皮細胞活性顯著下降了25％左右,而平滑肌細胞活性顯著增加了10％左右,該結(jié)果與文獻的報道一致。因此,選擇4dyn/cm2大小的剪切力和12h的作用時間來建立藥物篩選模型。
　?、弁ㄟ^考察同心血管疾病相關的一些重要指標(內(nèi)皮細胞的形態(tài)和凋亡率、平滑肌細胞的遷移率、細胞產(chǎn)生的血小板衍生生長因子

7、、超氧化物歧化酶和丙二醛的含量)在藥物篩選模型中的變化,以及考察抗心血管疾病藥物(曲匹地爾和丹參提取物)在該模型中的作用,驗證了藥物篩選模型的有效性。與正常條件下的共培養(yǎng)細胞相比,藥物篩選模型中,內(nèi)皮細胞的形態(tài)發(fā)生了損傷性的變化,細胞形態(tài)指數(shù)增加至0.86,細胞凋亡率顯著增高達到20.40％;平滑肌細胞的遷移率為正常條件下的1.8倍;血小板衍生生長因子和丙二醛的產(chǎn)生量分別增加至14.5ng/mL和1.47nmol/mg蛋白質(zhì);超氧化物歧

8、化酶的含量顯著降低至21.46U/mg蛋白質(zhì)。將曲匹地爾作用于藥物篩選模型后,內(nèi)皮細胞的形態(tài)得到了很好的修復,細胞的形態(tài)指數(shù)恢復至0.64,也顯著地抑制了內(nèi)皮細胞的凋亡,血小板衍生生長因子的含量顯著降低,但是超氧化物歧化酶和丙二醛的含量沒有顯著變化。將丹參提取物作用于藥物篩選模型后,內(nèi)皮細胞的形態(tài)也得到了很好的修復,細胞的形態(tài)指數(shù)恢復至0.71,也顯著地抑制了內(nèi)皮細胞的凋亡,促進了超氧化物歧化酶的生成且抑制了丙二醛的生成,但是血小板衍生

9、生長因子的含量沒有顯著變化。通過對這些指標的檢測,以及和正常條件下細胞進行對比分析,證明了我們所建立的藥物篩選模型成功地模擬了血管的病理狀態(tài),藥物在模型中能很好的發(fā)揮其藥理藥效作用,并且藥物在該模型中的藥理作用與臨床上研究報道的藥理作用相符,證明了藥物篩選模型的有效性。
　?、芾迷撃M血管微環(huán)境的藥物篩選模型對丹參提取物中抗心血管疾病的活性成分進行篩選,并與傳統(tǒng)的藥物篩選模型(H2O2氧化損傷模型)進行了對比。高效液相色譜分析表

10、明,丹參提取物原液中有19個主峰,通過保留時間和標準物法,推斷出其中的9個成分,包括丹參素、原兒茶醛、原兒茶酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮I、隱丹參酮亞甲基丹參醌和丹參酮IIA。傳統(tǒng)的藥物篩選模型篩選到15種化合物,包括所有丹參提取物原液中定性的9種成分,而模擬血管微環(huán)境的藥物篩選模型僅篩選到9種化合物,其中包括丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、隱丹參酮和丹參酮IIA,這五種物質(zhì)都具有抗心血管疾病的效果。然而,利用傳統(tǒng)的藥物模型篩選到的一