1、骨缺損修復是當前骨科領域研究的難題之一，傳統(tǒng)的自體或異體骨移植治療方法都存在各自難以克服的缺點，因此人們一直在進行人工植骨材料的研究，開發(fā)了一系列骨移植替代材料。在這些材料中磷酸鈣骨水泥(calciumphosphatecement，CPC)以其良好的生物相容性和骨傳導性引起人們的廣泛重視。CPC是由一種或幾種磷酸鹽的粉末加上稀酸或生理鹽水調和而成的一種新型自固化型人工骨替代材料，其固化后終產物為羥基磷灰石(HA)結晶。目前CPC因其良

2、好的生物相容性、骨傳導性、可塑形性及聚合時不放熱等優(yōu)點而被應用于臨床骨缺損修復，同時可作為生長因子的載體。但臨床應用中發(fā)現CPC存在以下問題：1)CPC孔徑較小、孔隙率較低，不利于材料的降解和新骨的長入。2)不具備骨誘導能力，即使其與骨誘導因子BMP復合后BMP的釋放速度緩慢，不利于充分發(fā)揮BMP誘導活性。 本研究首次將采用復乳-溶劑揮發(fā)法制備的BMP/聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)載體微球與CPC復合，制備具有更高可降解性

3、及成骨活性的新型骨修復材料。其基本設計思路為：在材料植入早期PLGA微球不僅可作為BMP的載體微粒提高BMP的釋放，同時可維持材料一定的強度，隨著微球的降解可在CPC內形成規(guī)則的空隙，從而提高CPC的孔徑及孔隙度，加快材料的降解和BMP的釋放。本文對這一復合材料進行了系列研究，包括制備工藝、理化特性、生物學相容性和成骨活性等，并用于動物骨缺損修復實驗，為其進一步研究提供理論依據。 1rhBMP-2/PLGA載藥微球的制備及成骨活

4、性研究采用復乳-溶劑揮發(fā)法制備W/O/W型rhBMP-2/PLGA載藥微球，并在電鏡下觀察微球形態(tài)。為得到適合粒徑的微球，選擇影響微球粒徑的主要因素包括PLGA濃度、乳化劑PVA濃度、油水相之體積比(PLGA/PVA)進行正交分組試驗，以優(yōu)化微球的制備工藝。采用ELISA法測定微球的載藥率及體外28天內的釋藥速度，并將載藥微球植入鼠股部肌袋，通過X線、組織學檢查評價載體材料的異位成骨能力。結果顯示：采用優(yōu)化方案制備的載藥微球粒徑為253

5、±64μm，載藥率0.52％±0.14％，載藥微球rhBMP-2體外釋放呈雙相，24h釋藥率為15.2％±0.8％，隨后呈持續(xù)緩慢釋放，28天時達48.6％±5.3％。載藥微球植入鼠股部肌袋4W材料周圍有明顯的骨形成。實驗結果表明：通過復乳-溶劑揮發(fā)法制備PLGA微球可以作為BMP的緩釋載體。 2rhBMP-2/PLGA微球/CPC復合人工骨制備及理化特性研究將攜載rhBMP-2的PLGA微球與rhBMP-2/磷酸鈣骨水泥(CP

6、C)分別以0∶100、50∶50、60∶40、70∶30體積比復合，制備出rhBMP-2/PLGA微球/CPC復合人工骨。用掃描電鏡(SEM)、萬能生物力學測試儀、X線衍射分析(XRD)分析材料形貌、固化時間、組份變化、抗壓強度，同時測定不同時間材料體外降解液Ca、P離子濃度變化，以探討微球的摻入對CPC的固化過程和理化性能的影響，以及以怎樣的配比能使這些影響減至最小。結果發(fā)現：隨BMP/PLGA微球的摻入，復合材料的固化時間輕度增加，

7、抗壓強度由(29.48±6.42)MPa下降至(8.26±3.58)MPa，但復合材料的抗壓強度仍明顯高于PLGA微球降解后材料的強度。復合材料XRD圖中除出現PLGA的衍射峰外無其它峰出現。SEM檢測微球均勻鑲嵌于CPC中，微球完全降解時可在材料中形成相互連接的大的微孔。不同時間微球摻入復合材料組降解液的Ca、P離子濃度均高于對照。根據以上測定結果選取60∶40為PLGA/CPC最優(yōu)體積比進行隨后試驗。實驗結果證明：BMP/PLGA微

8、球的摻入對于材料的固化時間及力學強度產生輕度影響，可明顯提高材料的降解速度。 3rhBMP-2/PLGA微球/CPC復合人工骨生物相容性研究采用復乳溶劑揮發(fā)方法制備空載PLGA微球，并將其與CPC復合制備PLGA微球/CPC復合人工骨。制備材料體外浸泡第1天、第7天的24h浸提液，將材料及其浸提液分別與人骨髓基質干細胞(MSCs)體外共培養(yǎng)，通過SEM觀察、MTT、ALP、OC測定，探討復合材料的細胞粘附能力及其浸提液對于人MS

9、Cs增殖和成骨分化的影響。SEM結果顯示：復合材料與MSCs細胞可良好粘附、增殖，細胞形態(tài)正常。與單純CPC材料相比較。體外培養(yǎng)時復合材料不同時間的浸提液對MSCs細胞的增殖具有促進作用，對于細胞成骨分化的影響與單純CPC無明顯差別。證明rhBMP-2/PLGA微球/CPC新型復合人工骨具有良好的生物相容性。 4rhBMP-2/PLGA微球/CPC復合人工骨BMP體外釋放及活性研究將rhBMP-2/CPC、rhBMP-2/PLG

10、A微球/CPC試件置于PBS釋放介質中，1d、3d、7d、14d、28d時取上清行rhBMP-2含量ELISA檢測。同時將第1天、第7天時材料24h的釋放液與MSCs體外共培養(yǎng)，通過MTT測定、ALP染色、細胞ALP、OC表達測定來分析材料釋放的BMP活性。釋藥測定結果顯示：復合材料24h的BMP體外釋放率為8.3％，隨后28天緩慢釋放，不同時間點的釋藥率均高于BMP/CPC組。不同材料BMP釋放液與MSCs體外共培養(yǎng)結果顯示：MSCs

11、的ALP、OC表達與BMP的釋放有劑量依存關系。從而表明復合材料可以作為BMP的載體，其具有良好的緩釋效果，釋放的BMP仍保持其骨誘導活性。 5rhBMP-2/PLGA微球/CPC復合人工骨的異位成骨活性研究將制備的rhBMP-2/CPC、rhBMP-2/PLGA微球/CPC塊分別植入小鼠兩側股部肌袋內，術后2周、4周取材，進行大體觀察、X線、組織學檢測，觀察成骨狀況和組織學反應，以評價載體材料的組織相容性及異位成骨能力。X線檢

12、查示材料植入4周在復合材料周圍有高密度影出現，組織學觀察兩種植入物在植入初期周圍均有輕度非特異性炎癥反應，材料周圍有軟骨細胞出現。4周后炎癥消失，材料周圍出現有新骨，rhBMP-2/PLGA微球/CPC組成骨量明顯高于rhBMP-2/CPC對照組。表明復合材料具有較強的異位誘導成骨能力。 6rhBMP-2/PLGA微球/CPC復合人工骨修復兔骨缺損將制備出rhBMP-2/PLGA微球/CPC復合人工骨及rhBMP-2/CPC分別

13、植入兔雙側股骨髁骨缺損區(qū)域，術后4周、8周、12周取材，進行大體觀察、X線、組織學及骨組織計量學檢測，觀察比較不同時期材料的降解及成骨情況，以評價材料修復骨缺損能力。X線檢查結果示：復合材料植入8周術后，材料密度明顯減低，邊緣模糊，12周植入材料已大部分吸收，而rhBMP-2/CPC組12周時未見材料的降解吸收征象。組織形態(tài)學觀察示：rhBMP-2/PLGA微球/CPC復合材料植入8周組材料已部分降解，微球降解所形成的孔洞內有新生骨組織

14、，rhBMP-2/CPC組僅在材料周邊區(qū)域有少量降解及成骨。12周時，rhBMP-2/PLGA/CPC組材料大部分降解，骨缺損區(qū)新生骨的面積百分比為49％，而rhBMP-2/CPC組僅為18％。提示作為骨缺損的修復材料rhBMP-2/PLGA微球/CPC復合人工骨具有良好的降解性和成骨活性。 以上試驗結果表明：采用復乳溶劑揮發(fā)法制備的rhBMP-2/PLGA微球的摻入可提高CPC材料的降解速度和BMP的釋放，從而提高材料的降解性