1、前言：
　　Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)最廣泛和最重要的第二信使之一,在心肌細(xì)胞的興奮-收縮耦聯(lián)、物質(zhì)代謝、細(xì)胞周期調(diào)控與細(xì)胞間通信等活動中發(fā)揮重要作用。心肌細(xì)胞胞內(nèi)[Ca2+]信號的研究是探索心臟疾病病理生理機(jī)制的重要課題之一。鑒于[Ca i2+]在生物學(xué)上的重要性,研究者建立了多種在細(xì)胞和(或)亞細(xì)胞水平上對[Ca i2+]活動機(jī)制進(jìn)行觀測的方法和技術(shù):如單光子和雙光子共聚焦顯微鏡、全內(nèi)反射熒光顯微鏡、寬視野顯微鏡和低噪CCD照相機(jī)的聯(lián)

2、用等。近十幾年來,隨著激光共聚焦顯微鏡技術(shù)的發(fā)展及鈣離子熒光指示劑的更新,其精確性及高分辨率等特征大大提高了人們對心肌胞內(nèi)Ca i2+信號分子的影像觀測及三維重組能力;這為功能學(xué)研究提供了方便直觀的活的細(xì)胞Ca2+信號圖像,從而人們對細(xì)胞內(nèi)鈣信號圖像特征及調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識進(jìn)一步深入。
　　在本研究中,我們采用LSM510 META型激光共聚焦顯微鏡,在快速面掃描和線掃描模式下記錄胞外低Ca2+、胞外高Ca2+及β受體激動劑異丙腎上腺

3、素(Isoproterenol, ISO)、阻滯劑普萘洛爾(Propranolol, pro)對心室肌細(xì)胞靜息鈣水平(resting[Ca2+])的改變及電場刺激誘發(fā)的鈣瞬變的影響效應(yīng)并分析其機(jī)制,探討了胞內(nèi)鈣信號與心肌細(xì)胞功能活動(產(chǎn)生鈣瞬變和收縮的能力)的關(guān)系和變化規(guī)律。希望為臨床心血管疾病的治療或防治提供一定的理論依據(jù)。i
　　目的：
　　1.建立激光共聚焦顯微鏡下心肌胞內(nèi)鈣信號研究模型及方法。
　　2.應(yīng)用激光

4、共聚焦顯微鏡成像技術(shù)研究胞外低Ca2+及高Ca2+環(huán)境對心肌胞內(nèi)鈣信號的影響及其機(jī)制。
　　3.應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)研究β受體激動劑及阻滯劑對心肌胞內(nèi)鈣信號的影響。
　　材料和方法：
　　選用體重200~300g的成年SD大鼠,使用改良的Langendorff裝置,以膠原酶+蛋白酶主動脈逆向灌流法急性分離心室肌單細(xì)胞,經(jīng)過三步梯度復(fù)鈣法復(fù)鈣,靜置1~2h后與熒光指示劑Fluo4-AM孵育染色;置于Zeiss L

5、SM510-META型倒置激光共聚焦顯微鏡下,由NEC-7203型電子刺激器提供同步閾上電場刺激心肌細(xì)胞產(chǎn)生興奮,誘發(fā)胞內(nèi)鈣瞬變;胞內(nèi)鈣信號圖像由共聚焦系統(tǒng)實(shí)時記錄。有關(guān)藥物通過自制多管道給藥系統(tǒng)灌流供給;主要觀測不同濃度胞外鈣(分別含0.0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mmol\L Ca2+)、不同濃度β受體激動劑(分別含0.1、0.2、0.5、1.0μmol\L ISO)、β受體激動劑及阻滯劑

6、(1.0μmol\L ISO+4.0μmol\L propranolol)對心肌胞內(nèi)鈣信號(靜息鈣水平和誘發(fā)鈣瞬變)的作用。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為自身前后對照。鈣信號圖象數(shù)據(jù)的處理及分析使用自編的圖像分析處理程序,編程語言為IDL6.2(Research Systems,Inc.,Boulder,CO)。胞內(nèi)靜息鈣水平以熒光強(qiáng)度F0表示。而誘發(fā)鈣瞬變以標(biāo)準(zhǔn)熒光強(qiáng)度(normalized fluorescence)的凈變化即?F/F0表示,其中F0表

7、示靜息狀態(tài)的熒光強(qiáng)度。
　　結(jié)果：
　　1.采用本科室改進(jìn)的Langendorff法急性分離的SD大鼠心肌細(xì)胞,約有85％-95%的細(xì)胞形態(tài)呈長桿狀,可得40%~60%鈣穩(wěn)態(tài)心肌細(xì)胞;與鈣熒光染料Fluo4-AM孵育后給予閾上場刺激,在共聚焦顯微鏡下可記錄到典型的鈣瞬變圖像。
　　2.胞外低鈣對心肌胞內(nèi)鈣信號的影響:
　　在本研究中,胞外正常灌流液含鈣1mM。當(dāng)胞外鈣濃度逐漸變?yōu)?.5mM時,發(fā)現(xiàn)有3/7誘發(fā)鈣瞬

8、變變化不明顯,2/7誘發(fā)鈣瞬變明顯增強(qiáng),另有2/7誘發(fā)鈣瞬變有所減弱;多數(shù)(6/7)誘發(fā)鈣瞬變的時程(從上升相的半高峰處到下降相的半高峰處所持續(xù)的時間)有所延長,鈣瞬變前沿不整齊現(xiàn)象不明顯。當(dāng)胞外鈣濃度逐漸變?yōu)?.2mM時,誘發(fā)鈣瞬變有所增強(qiáng)的約有40%(2/5),其余的變化不明顯;所有誘發(fā)鈣瞬變的時程均延長( P<0.05)*(由正常灌流液的222.5+/-36.9ms變?yōu)?.2mM時的247.4+/-37.9ms),鈣瞬變前沿均變得

9、不整齊(因?yàn)閯傞_始時有些部位鈣內(nèi)流太弱,不足以觸發(fā)胞內(nèi)鈣釋放;后因?yàn)榕R近部位鈣信號的增強(qiáng),循鈣誘導(dǎo)鈣釋放的原則而引起全細(xì)胞范圍的鈣釋放)。當(dāng)胞外鈣濃度逐漸變?yōu)?.1mM時,約有一半(3/6)的細(xì)胞的誘發(fā)鈣瞬變明顯逐漸減弱,但最終并未完全消失;另有一半(3/6)細(xì)胞在灌流開始不久時鈣瞬變有所增強(qiáng)且時程延長。當(dāng)胞外鈣濃度逐漸變?yōu)?.05mM時,可見開始時誘發(fā)鈣瞬變有所增強(qiáng),之后逐漸減弱,但最終胞內(nèi)仍可見場刺激引起的微弱鈣信號存在(10/10

10、)。當(dāng)胞外鈣濃度逐漸變?yōu)?mM(無鈣臺式液)時,心肌細(xì)胞的誘發(fā)鈣瞬變均逐漸減弱,并最終消失(5/5)。
　　總之,隨胞外鈣濃度從正常情況下的1mM最終降至0mM的過程中,給予心肌細(xì)胞閾上場刺激,一般的變化過程是:剛開始(灌流約1分鐘時)仍可誘發(fā)鈣瞬變和細(xì)胞收縮,且誘發(fā)鈣瞬變強(qiáng)度有增強(qiáng)趨勢,后誘發(fā)鈣瞬變前沿變得不整齊;隨胞外鈣繼續(xù)降低,誘發(fā)鈣瞬變減弱且不連續(xù)(有些部位有胞內(nèi)鈣釋放,有些部位沒有),再往后胞內(nèi)鈣釋放逐漸不明顯,再往后則

11、只有少量胞外鈣內(nèi)流而無胞內(nèi)鈣被觸發(fā)釋放;當(dāng)胞外鈣濃度為0mM時,誘發(fā)鈣瞬變消失,心肌細(xì)胞失去收縮能力。
　　3.胞外高鈣對心肌胞內(nèi)鈣信號的影響:
　　當(dāng)胞外鈣濃度由1mM逐漸變?yōu)?mM時,胞內(nèi)靜息鈣水平(熒光強(qiáng)度)處理前后沒有明顯差異;誘發(fā)鈣瞬變峰值(?F/F0)差別也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義也。當(dāng)胞外鈣濃度由1mM逐漸變?yōu)?mM時,胞內(nèi)靜息鈣水平改變處理前后有明顯差異( P<0.05);誘發(fā)鈣瞬變峰值(?F/F0)灌流后峰值明顯降低(

12、 P<0.05)。當(dāng)胞外鈣濃度由1mM逐漸變?yōu)?0mM時,胞內(nèi)靜息鈣水平處理前后有明顯差異( P<0.05),且高于胞外鈣濃度為5mM時的靜息鈣水平( P<0.05);誘發(fā)鈣瞬變峰值(?F/F0)灌流后峰值明顯降低( P<0.05),且低于胞外鈣濃度為5mM時的峰值( P<0.05)。4.β受體激動劑及阻滯劑對心肌胞內(nèi)鈣信號的效應(yīng):
　　當(dāng)ISO為0.1μM時,胞內(nèi)靜息鈣水平下降,灌流0.1μM ISO后胞內(nèi)靜息鈣水平降低( P<

13、0.05);灌流0.1μM ISO后心肌細(xì)胞的誘發(fā)鈣瞬變峰值(?F/F0)升高,前后相對比值為1.24±0.07,可見灌流0.1μM ISO后心肌細(xì)胞的誘發(fā)鈣瞬變峰值顯著增大( P<0.01)。當(dāng)ISO為0.2μM時,胞內(nèi)靜息鈣水平也下降,灌流0.2μM ISO后胞內(nèi)靜息鈣水平降低( P<0.05);灌流0.2μM ISO后心肌細(xì)胞的誘發(fā)鈣瞬變峰值升高明顯,心肌細(xì)胞的誘發(fā)鈣瞬變峰值顯著增大( P<0.01)。當(dāng)ISO為0.5μM時,胞內(nèi)

14、靜息鈣水平降低( P<0.05),心肌細(xì)胞的誘發(fā)鈣瞬變峰值顯著增大( P<0.01)。當(dāng)胞外ISO為1.0μM時,胞內(nèi)靜息鈣水平降低( P<0.05),誘發(fā)鈣瞬變峰值增大( P<0.05)。
　　在另一組實(shí)驗(yàn)中,胞內(nèi)靜息鈣水平由正常時的12.18±1.04降為1.0μM ISO時的10.53±0.90,再加入4.0μM Propranolol(β-受體阻斷劑)后靜息鈣水平升高至11.62±1.11,洗去胞外ISO及Proprano

15、lol后靜息鈣水平為12.94±1.47(n=7);可見ISO對胞內(nèi)靜息鈣水平的降低作用可被其阻斷劑Propranolol所阻斷( P<0.05);灌流1.0μM ISO后心肌細(xì)胞的誘發(fā)鈣瞬變峰值由正常時的8.40±0.69增強(qiáng)為10.82±0.77,加入4.0μM Propranolol后誘發(fā)鈣瞬變峰值為7.70±0.43;洗去胞外ISO及Propranolol后誘發(fā)鈣瞬變峰值為7.17±0.79;,可見ISO對誘發(fā)鈣瞬變峰值的增強(qiáng)作

16、用也可被其阻斷劑Propranolol所阻斷( P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立了激光共聚焦顯微鏡下心肌胞內(nèi)鈣信號研究模型與方法,獲得了一系列胞內(nèi)鈣信號圖像,為完整心肌細(xì)胞鈣信號數(shù)字化圖譜的有機(jī)組成部分。
　　2.胞外低鈣環(huán)境下誘發(fā)鈣瞬變幅度下降,但時程延長,并有興奮-收縮脫耦聯(lián)發(fā)生。
　　3.胞外高鈣環(huán)境下心肌細(xì)胞內(nèi)靜息鈣離子熒光信號強(qiáng)度增強(qiáng)提示細(xì)胞鈣穩(wěn)定性下降及鈣超載;隨胞外鈣濃度增大誘發(fā)鈣瞬變