1、鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文人食管癌Eca109細(xì)胞膜抗原篩選的初步研究姓名：孫濤申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：病理與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：董子明趙明耀20030520鄭州人學(xué)2003脯壩J研究生畢業(yè)論義人食管痛Eca109細(xì)胞膜抗原篩選的初步研究(即mg去垢FIJ／mg膜蛋門)。3以超濾法純化膜蛋白并分組：以超濾法將膜蛋白從以TritonX一100作去垢劑的成分中按分子量大小分出100KDa兩個(gè)絹，并測(cè)定各組膜蛋白濃度。4檢測(cè)Eca一109細(xì)胞的HL

2、A表型及篩選健康志愿者：使用HLA引物試劑盒，瓊脂糖凝膠電泳(agarosegelelectrophoresis)觀察聚合酶鏈反1、’V(polymerasechainreaction，PCR)擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物，用擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)鑒定出Eca109細(xì)胞的HLA表型。采用血清學(xué)HLA分型技術(shù)，尋找至少有。個(gè)位點(diǎn)與Eta109細(xì)胞HLA相匹配的健康志愿者。5人外周向DC的培養(yǎng)：取篩選卅的志愿者的外周血，密度梯度離心法獲得外周血單個(gè)核jJ包(

3、peripheralbloodmononuclearcells，PBMC)，用含粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激[]子(granulocyte—macrophagecolonystimulatingfactor，GM—CSF)、白細(xì)胞介素4(interleukin一4，IL一4)及該志愿者血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度后，加入24孔板中培養(yǎng)。于培養(yǎng)的第4天，根據(jù)一定比例加入膜蛋白及hTNF—a刺激DC成熟，于第10天收獲成熟的懸浮DC。

4、6人外周J：fILT細(xì)胞的培養(yǎng)：在IL2維持下，流式細(xì)胞儀檢測(cè)此志愿者PBMC的分化情況。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，再提取PBMC，經(jīng)過(guò)換培養(yǎng)瓶及PHA刺激，以含hIL一2的RPMI一1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)PBMC4周，收集純化的T細(xì)胞。7，MTT法測(cè)定致敏T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性：以純化的T細(xì)胞為效慮細(xì)胞，加入負(fù)載抗原的成熟DC，以8：l、16：1、32：1的效靶比分別加入Eca一109細(xì)胞(其為靶細(xì)胞)；同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組及效應(yīng)對(duì)照組，各組

5、設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用MTT法在96孔板中測(cè)定CTL的細(xì)胞毒活性。結(jié)果1在pH63的條件下，適當(dāng)?shù)娜ス竸┡c膜蛋白之比(IIImg去垢齊l／mg膜蛋白)，在使用辛基13一葡糖苷時(shí)為6：1；使用TritonX一100時(shí)為2：1。2Eca109細(xì)胞的HLA的基因分型為A03，A24；B35，B’37：DRBlDRBl’12；DRB3。并找到一例表型為A03雜合了的健康志愿者。3PBMC的分化情況：健康人PBMC，只在IL2維持下，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其分